[发明专利]一种以幼穗为外植体的甜高粱高频再生体系建立的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，特别是涉及一种以幼穗为外植体的甜高粱高频再生体系建立的方法。

背景技术

甜高粱(Sorghum bicolor(L.)Moench)又称糖高粱，是普通粒用高粱的一个变种，具有抗旱、耐涝、耐贫瘠、耐盐碱等特性，适宜在盐碱干旱等边际性土壤种植，同时，甜高粱生长快、产量高，茎秆糖汁含量丰富，因此，被誉为“生物能源系统中最有力竞争者”(Antonopoulou et al.2008；Carpita et al.2008)。甜高粱作为最具优势的再生能源作物，已经引起广泛关注(Rooney 2004；Farrell，2006)。2009年，美国能源部联合基因组研究所等机构完成了粒用高粱基因组测序和分析工作(Andrew et al.2009)，这极大地推动了甜高粱分子遗传学的深入研究。目前，迫切需要通过转基因技术挖掘和鉴定优异的抗逆境胁迫基因，进而应用于甜高粱品种的定向遗传改良。迄今为止，甜高粱的遗传转化工作研究开展规模较小，技术发展缓慢。因此，建立高效稳定的甜高粱再生体系用于遗传转化，已成为当前亟待解决的首要问题。

目前针对甜高粱组织培养的研究还很少。粒用高粱研究相对较早，为我们研究甜高粱提供了依据和参考。1970年Masteller等以芽原基为外植体，诱导出愈伤组织，并获得了再生植株，这是通过组织培养获得高粱再生植株的最早报道。此后，各国学者相继开展了高粱组织培养的研究工作，现已从高粱幼胚(Dunstan et al.1979；Elkonin et al.1995；Ma et al.1987；Sairam et al.2000；Zhao et al.2000；Hagio 2002)、成熟胚(Mackinnon et al.1986；Cai et al.1987)、茎尖(Nahd et al.1995；Kishore et al.2006)、籽粒(Yang et al.1990)和幼叶(Wernicke et al.1980；Sairam et al.1999)等不同外植体上均获得了再生植株，幼穗具有分化率高、易获得再生植株的优点，被认为是高粱组培理想的外植体(Brettell et al.1980；Wen et al.1991；Kaeppler et al.1997；Mani et al.2003；Jogeswar et al.2007)。

高粱的组织培养受基因型影响较大(Kaeppler et al.1997；Hagio 1994；Kuruvinashetti et al.1998)，缺少优良受体基因型是高粱遗传转化研究工作发展缓慢的主要原因。获得愈伤诱导与分化再生能力强的基因型，是转化成功的先决条件。迄今尚未见报道。

发明内容：

本发明提供一种以幼穗为外植体的甜高粱高频再生体系建立的方法，以用于甜高粱的遗传转化研究。

本发明采取的技术方案是，包括如下顺序步骤：

1)选取甜高粱剑叶期2～3cm的幼穗，切成小段；

2)接种于诱导培养基上培养，形成愈伤组织，诱导培养基为：MS基本培养基+2，4-D 3mg/L+KT(激动素)0.5mg/L+30g/L蔗糖+8.0g/L琼脂pH5.8；

3)将诱导出的愈伤组织转移到继代培养基中培养，继代培养基为：MS基本培养基+2，4-D 1.5mg/L+KT(激动素)0.25mg/L+30g/L蔗糖+8.0g/L琼脂pH5.8；

4)继代培养30天后，将愈伤组织转接到分化培养基中培养至出苗，分化培养基为：MS基本培养基+IAA(吲哚乙酸)1mg/L+KT(激动素)0.5mg/L+抗坏血酸10mg/L+30g/L蔗糖+8.0g/L琼脂pH5.8；

5)将再生苗转移至生根培养基中进行根的诱导，生根培养基为：1/2MS培养基+30g/L蔗糖+8.0g/L琼脂pH5.8；

6)移栽到温室或大田。

所述幼穗长度为2～3cm，在-4℃冰箱中放置2天，切成2-3mm长。

所述诱导培养基中培养条件为：于25±2℃暗培养30天。

所述继代培养为7天继代一次。

所述分化培养基中培养条件为：于25±2℃下16h/d光照培养。

所述再生苗长至约5cm高时，移至生根培养基中。

所述甜高粱品种为FETERITA NIDIANA、MN-2949、MN-2904、MN-3013和SILVER TOP-1。