[发明专利]检测洋葱腐烂病菌的核苷酸序列和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及检测洋葱腐烂病菌的核苷酸序列和试剂盒，属于植物检验检疫领域。

背景技术

洋葱腐烂病菌（Burkholderia gladioli pv. alliicola）隶属于原核生物界(Procaryoces)、薄壁菌门(Gracilicutes)、肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、唐菖蒲伯克霍尔德菌（Burkholderia gladioli）。唐菖蒲伯克霍尔德菌（Burkholderia gladioli）是一种引起唐菖蒲球茎腐烂的病原菌，Severini在1913年的文献中最早描述了这种病原菌，并将其命名为Pseudomonas gladioli。1992年，Pseudomonas gladioli与其它六个同属于假单胞菌属（Pseudomonas） rRNA Group Ⅱ的菌种一起被划分到了一个新属——伯克霍尔德菌属（Burkholderia），从而被命名为Burkholderia gladioli。

洋葱腐烂病菌最初只是被当成一种植物病原菌。寄主植物主要是葱属植物（Allium cepa）和郁金香属（Tulipa spp.）。主要致病症状是鳞茎的内部鳞片腐烂，初期外观看不到症状，但后期整个鳞茎变软，可看到大量细菌分泌物。在叶片上也可产生干燥的坏死斑。洋葱腐烂病菌侵染洋葱叶片后，一到两片叶片会枯萎变白，并且脱落，病原菌由叶片再侵染至球茎。受侵染的洋葱鳞球茎，先期外部无明显特征，只在鳞球茎颈部出现腐烂，剖开后，发现内部一到两个小鳞茎已呈水浸状。后期肉质鳞状组织出现水浸状，由白黄色变为浅褐色，逐渐腐烂变软，在病害发病后期会有粘性、腐烂难闻液体流出，直至整个球茎变干、枯萎。田间发病率可达到 89.1 %。传播途径包括带菌种子、鳞球茎，土壤等。

1985年，Christenson首次报道了Burkholderia gladioli 感染囊性纤维化（CF，Cistic Fibrosis）病人呼吸道的病例。接着，陆续在慢性肉芽肿和免疫功能减弱的病人体内发现了Burkholderia gladioli。Burkholderia gladioli感染的病症还包括败血病、脓肿、骨髓炎、角膜炎和淋巴腺炎。Burkholderia gladioli可能主要导致CF病人的急性感染以及肺移植术后的血液感染，目前还没有Burkholderia gladioli在病人与病人之间传播的报道。

洋葱腐烂病菌是引起洋葱腐烂的高风险检疫性病菌，其准确检测和鉴定在检验检疫工作中具有重要意义。鉴于我国目前没有洋葱腐烂病的发生危害报道，为了减少境外洋葱腐烂病菌传入的风险、保护公众健康，本发明研究开发出一种特异的洋葱腐烂病菌检测技术。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供检测洋葱腐烂病菌的核苷酸序列。

本发明要解决的另一个技术问题是提供检测洋葱腐烂病菌的试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR检测引物，为序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的寡核苷酸序列。

检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR探针，为序列表SEQ ID No.3的寡核苷酸序列。

所述探针的5’端连接荧光报告基团FAM，3’端连接荧光淬灭基团BHQ1。

本发明根据 NCBI 数据库中 Burkholderia gladioli pv. alliicola ITS 基因序列保守区，设计并经大量筛选得到最佳引物和探针。探针5′端标记报告荧光染料6-Carboxy fluorescein (FAM)，3′端标记淬灭荧光染料BHQ1。引物和探针由宝生物工程有限公司合成。上游引物PBAF：5′- GCTTCCGCTATCCAAATTACTACTTC -3′（SEQ ID No.1）；下游引物PBAR：5′- ATGACAAATGTTCGAGTCAGTTGAC -3′（SEQ ID No.2）；探针为：FAM-ATTGTTAAAGAACGACAGCCGATAAGCACAC-BHQ1 （SEQ ID No.3）。