[发明专利]检测洋葱腐烂病菌的核苷酸序列和试剂盒

权利要求书

1.检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR检测引物，其特征在于：为序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的寡核苷酸序列。

2.检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR探针，其特征在于：为序列表SEQ ID No.3的寡核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR探针，其特征在于：所述探针的5’端连接荧光报告基团FAM，3’端连接荧光淬灭基团BHQ1。

4.检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR检测引物和检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR探针；所述检测引物为序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的寡核苷酸序列，所述探针为序列表SEQ ID No.3的寡核苷酸序列，探针的5’端连接荧光报告基团FAM，3’端连接荧光淬灭基团BHQ1。

5.检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于由以下组分组成：

（1）PCR反应液：由2×反应液Premix EX Taq、引物PBAF、引物PBAR和探针组成；其中，引物PBAF为序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，引物PBAR为序列表SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，探针为序列表SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，探针5′端标记报告荧光染料FAM，3′端标记淬灭荧光染料BHQ1；

（2）无DNA酶的灭菌纯化水；

（3）阴性对照：1mL×1管；研磨无菌健康洋葱鳞球茎，用0.01mol/L pH7.2 PBS缓冲盐溶液制成20%悬液，121℃灭活30min；

（4）阳性对照：1mL×1管；为含有洋葱腐烂病菌Bga核糖体基因保守区序列SEQ ID NO.4的重组质粒，Ct值为22.0～28.0。

6.根据权利要求5所述的检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述反应液Premix EX Taq的终浓度为1×，引物PBAF的终浓度为0.3uM、引物PBAR的终浓度为 0.3uM，探针的终浓度为0.1uM。

7.根据权利要求5所述的检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述阳性对照的制备方法为：用SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物序列对洋葱腐烂病菌进行PCR反应，回收PCR扩增产物，获得高纯度的138 bp 核糖体基因保守区序列SEQ ID No.4，与pGEM-T easy载体进行连接，转化E.coli Competent Cells DH5α感受态细胞，使用Takara MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver 2.0质粒提取试剂盒提取DNA，经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组质粒作为阳性对照，命名为pGEM-Bga；10倍连续梯度稀释裂解液，测定Ct值，Ct值为22.0～28.0者作为阳性对照。

8.根据权利要求5或6或7所述的检测洋葱腐烂病菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：该试剂盒还含有（5）细菌基因组DNA提取试剂盒。