[发明专利]一种检测宫颈癌血浆Bmi-1 mRNA的专用试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测宫颈癌血浆Bmi-1 mRNA的专用试剂盒，以及检测宫颈癌血浆Bmi-1mRNA表达量的方法，属于分子生物学检测技术领域。

背景技术

宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在女性恶性肿瘤中位居第二位，据统计，全球每年有新增病例49.3万，死亡约27.4万，严重危害妇女的身心健康。早期诊断和早期治疗是预防和控制宫颈癌的关键，宫颈癌如及时发现，并进行恰当的处理，其治愈率几乎达100％。传统的细胞学检查Pap细胞涂片检查，曾经大大降低了宫颈癌的死亡率，但其发展受到多方面的限制，如对细胞检查技术人员的要求高，存在判断主观性，另外取材也容易出现假阴性。阴道镜加上病理检查是早期宫颈癌检查的金标准，但其不适用于筛选检查。因此，寻找敏感性和特异性更强的早期诊断标志物，建立一种经济准确、安全有效的血清学宫颈癌筛查方法是目前关注的焦点。

近年来，肿瘤相关mRNA陆续在肿瘤患者的血浆/血清中被检测出来，为肿瘤的无创性早期诊断、治疗监测和预后判断提供了一条新的途径。并且，随着分子生物学技术的发展，通过实时荧光定量PCR方法检测血浆/血清中微量的肿瘤相关mRNA已成为可能。所谓实时荧光定量PCR技术是指在PCR反映体系中加入荧光基因，利用荧光信号的积累实时监测PCR的进程，最后通过标准曲线对待测模板进行定量分析。由于该技术具有敏感性高、重复性好、操作简便、检测快速等特点，目前已在临床核苷酸检测领域得到广泛应用。

Bmi-1(B cell-specific moloney leukemia virus integration site-1)基因为一种属于PcG(Polycomegroup)家族成员的致癌基因，自1991年在鼠淋巴瘤中被发现后即引起生物医学领域的高度关注。人类Bmi-1基因克隆和定位在10号染色体短臂13区，含有10个外显子和10个内含子。人类Bmi-1 cDNA长3203bp，共有959个腺嘌呤、591个胞嘧啶、678个鸟嘌呤和975个胸腺嘧啶。Bmi-1开放的阅读框编码一个含326个氨基酸的蛋白质，相对分子质量为44000-46000。氨基酸序列分析表明，Bmi-1蛋白有几个重要的模序：(1)环指模序(ring finger domain，RF)：位于N-末端的环指结构域，由锌指和C3HC4保守序列组成。Bmi-1通过环指与其他蛋白结合形成多聚复合物。RING结构域则控制着BMI-1蛋白在细胞核内的亚定位，该结构域缺失后BMI-1蛋白不再主要局限在细胞核边缘分布而是散在分布于整个细胞核中。(2)位于中心保守DNA结合模序螺旋-转角-螺旋-转角(DNA bandinghelix-turn-helix-turn motif，H-T-H-T)介导Bmi-1与DNA结合，可以和c-myc共同作用导致细胞增殖和肿瘤形成。HTHTHT结构域决定了Bmi-1的转录抑制功能，而与Bmi-1蛋白的分布无关。(3)Bmi-1蛋白分子内还有两个核定位信号(nuclear localization signal，NLS)——NLSI和NLS2，其中NLS2是Bmi-1蛋白定位于细胞核所必需的。(4)Bmi-1的C-末端部分是富含脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基的PEST区域，与Bmi-1蛋白在细胞内快速降解有关。Bmi-1基因作为c-myc癌基因的协同基因，在细胞的中心体扩增调节中起着重要的作用，异常的中心体可以导致染色体的异常分裂，最终使遗传稳定性发生改变，干扰细胞正常活动而发生癌变。目前已发现Bmi-1基因表达异常与人类多种肿瘤的发生、发展相关。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种快速、简便、准确的检测宫颈癌血浆中Bmi-1基因mRNA的专用试剂盒，以及检测宫颈癌血浆Bmi-1 mRNA表达量的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种检测宫颈癌血浆Bmi-1 mRNA的专用试剂盒，包括Bmi-1基因、GAPDH基因和EEF1A1基因的mRNA的引物，引物序列如下所示(如SEQUENCE LISTING所示)：

Bmi-1-F：5’-GAGCGTACTACATTGATGTCACAAC-3’；

Bmi-1-R：5’-GCTGGTCTCCAGGTCGCGAACAATA-3’；

GAPDH-F：5’-TGCACCACGAACTGCTTAGC-3’；

GAPDH-R：5’-GGCATGGACTGTTATCATGAG-3’；

EEF1A1-F：5’-CTGGCAAGTCCACCAAGTCT-3’；