[发明专利]一种检测宫颈癌血浆Bmi-1 mRNA的专用试剂盒及方法

权利要求书

1.一种检测宫颈癌血浆Bmi-1 mRNA的专用试剂盒，其特征在于：包括Bmi-1基因、GAPDH基因和EEF1A1基因的mRNA的引物，引物序列如下所示：

Bmi-1-F：5’-GAGCGTACTACATTGATGTCACAAC-3’；

Bmi-1-R：5’-GCTGGTCTCCAGGTCGCGAACAATA-3’；

GAPDH-F：5’-TGCACCACGAACTGCTTAGC-3’；

GAPDH-R：5’-GGCATGGACTGTTATCATGAG-3’；

EEF1A1-F：5’-CTGGCAAGTCCACCAAGTCT-3’；

EEF1A1-R：5’-CCGTTCTTCACCCACTGATT-3’。

2.根据权利要求1所述的检测宫颈癌血浆Bmi-1 mRNA的专用试剂盒，其特征在于：还包括PCR反应液，PCR反应液由Syber Green I荧光染料、DNA聚合酶、dNTPs、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钾和氯化镁组成。

3.根据权利要求2所述的检测宫颈癌血浆Bmi-1 mRNA的专用试剂盒，其特征在于：所述上游引物和下游引物的体积均为1μl，其中，Bmi-1-F、Bmi-1-R、GAPDH-F、GAPDH-R、EEF1A1-F和EEF1A1-R的浓度均为10μM；所述PCR反应液中，各组分的浓度为：DNA聚合酶的浓度为100U/ml，dNTPs的浓度为0.2mM，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的浓度为16.5mM，氯化镁的浓度为6mM，氯化钾的浓度为89.3mM和1×Syber Green I荧光染料。

4.一种检测宫颈癌血浆Bmi-1 mRNA表达量的方法，其特征在于，步骤如下：

(1)提取样本血浆的总RNA；

(2)RT-PCR扩增：将上述提取的mRNA进行反转录成cDNA，取cDNA为模板，加入引物和PCR反应液，进行PCR反应，检测样本阈值Cq(test sample)；同时以宫颈癌细胞株Hela细胞中提取mRNA，逆转录成cDNA作为校对样本，在每个PCR反应板中进行检测；

(3)制作标准曲线：从宫颈癌细胞株Hela细胞中提取mRNA，逆转录成cDNA，梯度稀释后，作为标准品，同步骤(2)进行RT-PCR扩增，检测CT值；然后拷贝数以10为底取对数作为横坐标，CT值为纵坐标作图，给出数据点的趋势线，制作标准曲线，计算斜率slope，然后根据公式E＝10^(-1/slope)-1，计算扩增效率E；

(4)计算：选中样本和校对样本检测孔，应用实时荧光定量PCR仪的随机软件得出样本阈值Cq(test sample)和校对样本阈值Cq(calibrator sample)，根据公式Q＝(E+1)^-ΔCq，ΔCq＝[Cq(test sample)-Cq(calibrator sample)]，得出基因的校正起始拷贝数Q；将样本目的基因Bmi-1的Q值与内参基因GAPDH基因和EEF1A1的Q值的几何平均数相比，得到目的基因Bmi-1的相对表达量。