[发明专利]一种鲜动物药药物组合物及其原料药的含量测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种测定方法，特别是涉及一种治疗原发性肝癌血瘀郁结证的鲜动物药药物组合物及其原料药的含量测定方法。

背景技术

本发明金龙胶囊(国药准字Z10980041)是癌症治疗药物，以药用动物(鲜守宫、鲜蕲蛇、鲜金钱白花蛇)组方的复方制剂，在抗肿瘤方面疗效确切。

金龙胶囊已颁布的药品标准(WS3-158(Z-036)-2001Z)对其产品质量的控制，包括：性状、鉴别、检查和含量测定4项，从目前SFDA对中药质量控制标准的要求，以及金龙胶囊原料药鲜守宫、鲜金钱白花蛇、鲜蕲蛇的化学及药理研究现状来看，目前含量测定项目采用了可见分光光度法，Folin-酚试剂测定总蛋白，该法的特异性较差，此外对于动物药中普遍存在的氨基酸、游离单糖、多糖及内源性一些小分子生命基本物质均未进行质量控制研究。

根据金龙胶囊质量控制标准现状，本发明以质量控制标准提高为出发点，对金龙胶囊中氨基酸进行测定，确定了金龙胶囊氨基酸检测的色谱条件，该色谱条件采用柱前衍生化法，方法学考察中精密度、稳定性及重现性良好。并且金龙胶囊中含有大量氨基酸，应用氨基酸测定可更好的控制药品质量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鲜动物药药物组合物的含量测定方法。本发明的另一目的在于提供一种鲜动物药药物组合物原料药的含量测定方法。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明药物组合物的含量测定方法包括如下步骤：

1、标准品溶液的制备

a、0.1mol/L盐酸溶液：取36％-38％的浓盐酸0.83体积份于100体积份量瓶中，加水稀释并定容至刻度；

b、17种氨基酸混合标准品溶液：17种氨基酸分别：天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸；

取17种氨基酸混合标准品溶液(购于安捷伦公司)25μL、50μL、100μL、200μL、400μL、800μL于0.5-1.5体积份容量瓶中，以0.1mol/L盐酸水溶液稀释并定容至刻度，得25-1000pmol/μL系列浓度的氨基酸混合标准品溶液；

c、1％苯酚的6mol/L盐酸溶液：取苯酚0.2-0.8重量份于30-70体积份棕色量瓶中，加入浓盐酸15-35体积份，加水溶解并定容至刻度；

d、10mol/L NaOH溶液：取NaOH 10-30重量份，置于30-70体积份量瓶中，加水溶解并定容至刻度，混匀，转移至塑料储瓶中备用；

e、40mol/L Na₂HPO₄缓冲液：取NaH₂PO₄ 3-8重量份，加水溶解并定容于500-1500体积份量瓶中，用10mol/L NaOH溶液调节pH值至7.8，混匀，即得；

2.供试品溶液的制备

a、游离氨基酸供试品溶液的制备：称取本发明药物组合物0.05-0.15重量份，置于25-75体积份量瓶中，加水溶解并定容至刻度，超声提取15-45分钟，离心5-15分钟，取上清液，过0.3-0.6μm微孔滤膜，得游离氨基酸供试品溶液；

b、总氨基酸供试品溶液的制备：称取本发明药物组合物0.05-0.15重量份，置于10-20体积份塑料离心管中，加水5-15体积份充分溶解后，超声提取15-45分钟，离心5-15分钟，取上清液，取0.05-1.5体积份上清液，置于安剖瓶中，加入含1％苯酚的6mol/L盐酸2-6体积份，真空充氮N₂15-45秒，迅速密封，置于80-150℃恒温干燥箱内水解12-32小时，取出，放冷至室温，加入1.2-3.6体积份10mol/L NaOH溶液，混匀，转移至5-15体积份量瓶中，加水稀释并定容至刻度，混匀，离心5-15分钟，取上清液，过0.45μm微孔滤膜，得总氨基酸供试品溶液；

3、色谱条件

色谱柱：4.6×150mm，3.5μm Zorbax Eclipse-AAA柱，流速：1.5ml/min，柱温为35℃，自动进样程序，紫外检测器于338nm处检测一级氨基酸，于262nm波长处检测二级氨基酸；以乙腈∶甲醇∶水＝25-65∶25-65∶5-15为流动相A，pH为7.8的40mmol/L Na₂HPO₄为流动相B，进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：