[发明专利]一种鲜动物药药物组合物及其原料药的含量测定方法

权利要求书

1.一种药物组合物的含量测定方法，其特征在该方法为包括如下步骤：

(1)标准品溶液的制备

a、0.1mol/L盐酸溶液

取36％-38％的浓盐酸0.83体积份于100体积份量瓶中，加水稀释并定容至刻度；

b、系列浓度17种氨基酸混合标准品溶液

17种氨基酸分别：天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸；

取17种氨基酸混合标准品溶液25μL、50μL、100μL、200μL、400μL、800μL于0.5-1.5体积份容量瓶中，以0.1mol/L盐酸水溶液稀释并定容至刻度，得25-1000pmol/μL系列浓度的氨基酸混合标准品溶液；

c、1％苯酚的6mol/L盐酸溶液

取苯酚0.2-0.8重量份于30-70体积份棕色量瓶中，加入浓盐酸15-35体积份，加水溶解并定容至刻度；

d、10mol/L NaOH溶液

取NaOH 10-30重量份，置于30-70体积份量瓶中，加水溶解并定容至刻度，混匀，转移至塑料储瓶中备用；

e、40mol/L Na₂HPO₄缓冲液

取NaH₂PO₄ 3-8重量份，加水溶解并定容于500-1500体积份量瓶中，用10mol/L NaOH溶液调节pH值至7.8，混匀，即得；

(2)供试品溶液的制备

a、游离氨基酸供试品溶液的制备

称取药物组合物0.05-0.15重量份，置于25-75体积份量瓶中，加水溶解并定容至刻度，超声提取15-45分钟，离心5-15分钟，取上清液，过0.3-0.6μm微孔滤膜，得游离氨基酸供试品溶液；

b、总氨基酸供试品溶液的制备

称取药物组合物0.05-0.15重量份，置于10-20体积份塑料离心管中，加水5-15体积份充分溶解后，超声提取15-45分钟，离心5-15分钟，取上清液，取0.05-1.5体积份上清液，置于安剖瓶中，加入含1％苯酚的6mol/L盐酸2-6体积份，真空充氮N₂15-45 秒，迅速密封，置于80-150℃恒温干燥箱内水解12-32小时，取出，放冷至室温，加入1.2-3.6体积份10mol/L NaOH溶液，混匀，转移至5-15体积份量瓶中，加水稀释并定容至刻度，混匀，离心5-15分钟，取上清液，过0.45μm微孔滤膜，得总氨基酸供试品溶液；

(3)色谱条件

色谱柱：4.6×150mm，3.5μm Zorbax Eclipse-AAA柱，流速：1.5ml/min，柱温为35℃，自动进样程序，紫外检测器于338nm处检测一级氨基酸，于262nm波长处检测二级氨基酸；以乙腈∶甲醇∶水＝25-65∶25-65∶5-15为流动相A，pH为7.8的40mmol/L Na₂HPO₄为流动相B，进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：

0-2.5min流动相A为0％，流动相B为100％；

2.5-16min流动相A为30％，流动相B为70％；

16-24min流动相A为57％，流动相B为43％；

24-24.8min流动相A为100％，流动相B为0％；

24.8-29.7min流动相A为100％，流动相B为0％；

29.7-30.9min流动相A为0％，流动相B为100％；

30.9-34.7min流动相A为0％，流动相B为100％；

(4)测定结果

所述药物组合物中检测到14种氨基酸，其中总蛋白质的含量为1.9％-2.85％，总游离氨基酸的含量为12.52％-18.78％，总氨基酸的含量为14.41％-21.62％；

所述药物组合物的原料药组成为：

鲜守宫700-2300重量份    鲜金钱白花蛇400-1100重量份

鲜蕲蛇400-1100重量份。