[发明专利]一种菌落PCR方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种菌落PCR方法及试剂盒。

背景技术

在细菌的研究过程中，菌株的分离及鉴定是非常重要的一个环节。随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定已经从以形态和生理生化为主的传统表型分类进入到各种基因型水平的分类。其中，由于16S rRNA基因由保守区和可变区组成，其大小在1.5kb左右，所以16S rRNA基因序列分析已经成为细菌种属鉴定和分类的标准方法。在这种方法中，PCR技术和测序技术发挥着重要的作用。PCR技术具有简便、快速、实用等特点，已广泛应用于生命科学研究的各个领域，在细菌的分类鉴定中更是发挥着极其重要的作用。

目前在细菌的分离鉴定中，利用PCR技术扩增16S rRNA序列时，通常采用基因组DNA的提取、菌体热裂解及冻融等方法进行PCR扩增。提取基因组DNA首先需要将分离的菌株进行液体培养，再通过酸酚法、碱酚法、SDS裂解法等提取其基因组DNA，最后采用PCR对16S rRNA基因进行扩增，对序列进行分析来鉴定菌株。该方法需要提取基因组DNA，因此周期长、且所用化学试剂对操作人员有害，不能满足菌株的快速鉴定的需要。

菌落PCR是一种不必提取基因组DNA，不必酶切鉴定，直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，通过16S rRNA基因序列的分析达到鉴定细菌的目的。其操作简单，快捷，省时少力。目前普通菌落PCR方法虽然简单、快速，但是其扩增效率经常比较低，而且稳定性也差。

发明内容

本发明要解决的技术问题为针对普通菌落PCR的扩增效率低且稳定性差的缺陷，提供了一种菌落PCR的方法，本发明所述方法扩增效率高，稳定性好。

本发明提供的菌落PCR方法，包括以下步骤：

1)取菌落在含溶菌酶或蜗牛酶的缓冲液中37℃水浴处理30～60min；

2)在沸水中煮10min，离心后取上清进行PCR反应。

溶菌酶(lysozyme)能够通过催化肽聚糖中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖残基间的β-1，4-糖苷键的水解，而破坏细菌的细胞壁。已广泛应用于医学、食品等领域。

蜗牛酶是从蜗牛的嗦囊和消化道中制备的混合酶，它含有纤维素酶，果胶酶，淀粉酶，蛋白酶等20多种酶。蜗牛酶是很有价值的一种酶，它可以用于酵母以及细菌细胞壁的破碎，因此广泛用于细胞生物学和基因工程学的研究。每克细胞经30～40mg酶在37℃保温1小时即可溶解细胞壁，破壁率达90％以上。利用过量的蜗牛酶或溶菌酶对菌落进行处理，能够有效地将细菌的细胞壁破碎，从而使其快速的释放出基因组DNA，达到高效稳定地进行菌落PCR的目的。

作为优选，所述溶菌酶浓度为0.4～0.5mg/mL。

作为优选，所述蜗牛酶浓度为3～4mg/mL。

发明人发现，用本发明所述方法单独利用蜗牛酶对约氏乳杆菌菌落处理进行PCR扩增，不能扩增出阳性条带的菌落，再单独使用溶菌酶处理后能够得到阳性条带，分析原因可能是蜗牛酶与溶菌酶的催化功能的差异造成的。提示本发明所述方法在应用过程中，用一种酶处理后进行PCR反应，如得不到阳性结果，可再用另一种酶处理后进行PCR反应，以达到互补且快速鉴定的目的。

更优选地，本发明的一种实施方式为，取菌落在含溶菌酶(蜗牛酶)缓冲液中37℃水浴处理30～60min；在沸水中煮10min，离心后取上清进行PCR反应，如为阴性结果，取菌落在含另一种酶-蜗牛酶(溶菌酶)的缓冲液中37℃水浴处理30～60min；在沸水中煮10min，离心后取上清再进行PCR反应。

作为优选，所述PCR的反应体系为ddH₂O 37.5μL，10×PCR缓冲液5μL，dNTP混合物4μL，Taq 0.5μL，细菌通用引物27F 1μL，细菌通用引物1492R 1μL，上清1μL。

作为优选，所述PCR反应条件为95℃ 10min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min 30s，共30个循环；72℃延伸10min。

本发明在传统菌落PCR的基础上，增加了对菌落的酶处理过程，使细菌的细胞壁得到更好的破碎，从而达到有效扩增的目的，本发明所述菌落PCR方法可适用于所有菌落，优选为乳酸菌、芽孢杆菌或酵母菌的菌落。