[发明专利]一种检测氯霉素的免疫层析试纸及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及氯霉素残留物的检测试剂，具体涉及一种检测氯霉素的免疫层析试纸及其制备方法。

背景技术

氯霉素(Chloramphenicol，CAP)，是一种有效的广谱抗生素，常用于动物各种传染性疾病的治疗，对多种病原菌有较强的抑制作用，曾在水产养殖业中得到广泛应用，同时也带来了水产品中氯霉素残留的严重问题。氯霉素由于存在严重毒副作用，已被许多国家和地区列为禁用药物。欧盟、美国等均在法规中规定CAP残留限量标准为“零容许量”，即不得检出。我国是一个水产养殖大国，养殖规模不断扩大，但养殖过程中滥用抗生素，已成为一个严重的水产品安全问题。为此我国在《动物性食品兽药残留规定》中规定可食部分不得检出，并且在出口的日常检测中，将其列为必检项目，一旦发现超标，一律禁止出口。目前现场筛查用检测试剂多用氯霉素胶体金试纸进行检测，但因其灵敏度低不能很好满足要求，因此需要开发可在现场更为准确和快速的检测方法。

基于抗原-抗体免疫学反应的侧流免疫层析检测技术(LFIAs)是20世纪90年代初发展起来的新兴技术，因其快捷方便的特性，非常适宜用于现场的快速监测。但目前该类技术多采用胶体金作为信号标记分子，受其灵敏度等的限制，只能用于定性检测。

超顺磁性复合粒子具有良好的磁学特性，由于其受背景干扰小，特别适宜于不含磁性物质的生物样品的检测。胶体金和荧光标记分子用于测流免疫层析检测时，只可在其检测区膜表面观测到约10％的信号分子强度，而用超顺磁性复合粒子作为标记材料，则可检测到检测区膜三维立体结构中的所有磁信号分子，可极大提高灵敏度，并可用对应的磁信号检测仪达到定量测定，因此，超顺磁性复合粒子是近年来在LFIAs中受到关注的材料。

然而，目前报道的生物检测用磁性纳米复合粒子多采用化学法如共沉淀法先制备得到有机相的磁性纳米粒子后，再采用硅(SiO₂)或聚苯乙烯、聚丙烯酸、明胶等高分子材料对其表面进行稳定化包覆修饰，以得到稳定的、水溶性的磁性标记材料。但这些制备修饰方法往往较为繁琐复杂，得到的超顺磁性复合粒子在尺寸大小、生物相容性、饱和磁强度、外磁场响应速度、稳定性和标记效率等方面不能同时满足LFIAs的要求：其尺寸多在200～300nm之间，由于磁珠颗粒偏大，在试纸上的泳动时间较慢，显色时间较长；而太小的粒子又无法提供足够的磁共振信号；另外还有生物相容性不稳定、磁珠容易聚合等问题；这些不足限制了超顺磁性复合粒子在LFIAs中的应用。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测氯霉素的免疫层析试纸。

本发明提供的检测氯霉素的免疫层析试纸，包括含有超顺磁性复合粒子标记氯霉素抗体的样品垫、连接于所述样品垫一端的反应垫、连接于所述反应垫另一端的吸水垫；所述反应垫包被有相互分离的检测线和质控线，所述检测线含有氯霉素抗原，所述质控线含有能与所述氯霉素抗体特异结合的抗抗体。

所述反应垫为硝酸纤维素膜；

所述超顺磁性复合粒子标记氯霉素抗体为将氯霉素抗体和超顺磁性复合粒子的以肽键共价结合形成的聚合体；

所述氯霉素抗体为氯霉素单克隆抗体或氯霉素多克隆抗体，所述氯霉素抗体具体为氯霉素单克隆抗体(云南大学单克隆抗体工程技术中心，CAP-001)；

所述氯霉素抗原为氯霉素半抗原与载体蛋白的偶联物；小分子抗原物质与载体蛋白偶联时，每个载体蛋白分子上所连接的半抗原的平均数目称为偶联比或结合比。为达到载体蛋白与NC膜的良好结合，同时又能最大程度地保证氯霉素半抗原空间位点的延展，选择合适的偶联比是非常重要的。偶联比的大小与半抗原功能基团的活性、位阻、反应投料比及反应条件有关。一般通过调节半抗原与载体的摩尔比、反应环境pH值、温度、离子强度等来控制偶联比。

所述载体蛋白与所述氯霉素半抗原的偶联比为1∶8～1∶10，适于抗原的包被和氯霉素半抗原空间位点的延展，所述载体蛋白与所述氯霉素半抗原的偶联比具体为1∶10；

所述与所述氯霉素抗体特异结合的抗抗体为羊抗鼠IgG抗体；

所述氯霉素抗原和所述羊抗鼠IgG抗体的浓度均为1mg/ml。

所述超顺磁性复合粒子标记氯霉素抗体按照如下方法制备：