[发明专利]一种分子信标荧光定量PCR检测邻苯二甲酸酯的方法

说明书

技术领域

本发明属于邻苯二甲酸酯的检测领域，特别涉及一种分子信标荧光定量PCR检测邻苯二甲酸酯的方法。

背景技术

邻苯二甲酸酯(PAEs)是塑料的增塑剂，是世界上生产量大，应用面广的人工合成有机化合物，它广泛应用于塑料工业。这类污染物已大量进人环境，普遍存在于土壤、底泥、水体、生物、空气及大气降尘物等环境样品中。由于PAEs的广泛存在，其对环境的影响渐渐凸显。研究证明，PAEs具有急性毒性、致癌性和致畸性等多种生物毒性。环境行为和生态效应研究表明，邻苯二甲酸酯水解和光解速率都非常缓慢，已成为一种全球性的环境有机污染物，被中国环境检测总站和美国EPA列为优先控制污染物。

关于邻苯二甲酸酯的检测有气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-质谱法(GC-MS)、荧光法等。用色谱法检测不但昂贵费时，而且分析过程繁琐冗长。近年来，随着生物技术的发展产生了许多邻苯二甲酸酯的生物检测方法。

荧光定量PCR是近年来出现的具有高灵敏度的定量PCR方法。PAEs于细胞质中的雌激素结合后，进一步与结合DNA复合后，形成PCR扩增的模板。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种分子信标荧光定量PCR检测邻苯二甲酸酯的方法，该方法具有灵敏度高，检出限低，特异性强的特点，可用于快速检测大批量样本中的邻苯二甲酸酯的含量，具有良好的应用前景。

本发明的一种分子信标荧光定量PCR检测邻苯二甲酸酯的方法，包括：

(1)将喂养于含邻苯二甲酸酯的水中的鲤鱼杀死并取出肝脏，用KCl溶液洗去血液，吸干水分，加入体积与肝脏质量比为4mL∶1g的HEDG缓冲液匀浆，离心取上清，即得含有受体的细胞溶质；

(2)将pUC19质粒稀释50倍作为模板，PCR扩增制得结合DNA，将结合DNA于琼脂糖凝胶电泳分离，最后纯化回收；

(3)将邻苯二甲酸酯倍比稀释为10^-1g/L-10^-9g/L，取10μL与250μL的细胞溶质混合，于20℃振荡温育2h；

(4)从上述混合物中取20μL加入1.5mLEP管中，20℃温育15min后，再加入2μL结合DNA，继续20℃温育15min得配体-受体-DNA复合物；从复合物中取12μL再加入2μL ExoIII(核酸外切酶III)缓冲液和6μL HEDG缓冲液，混匀后37℃温育15min，再加入ExoIII100U，混匀后37℃温育15min进行初次消解；取经初步消解的溶液5μL，加入15μL S1核酸酶混合液，于37℃温育30min进行再次消解；再加入1μL S1核酸酶停止液，70℃灭活15min；得到分子信标PCR的模板；

(5)以上述模板进行分子信标荧光定量PCR扩增，分子信标PCR循环40次后在72℃延伸5min，得加入邻苯二甲酸酯浓度与起始模板拷贝数的回归方程；其中，引物碱基序列为：上游引物R1：5′CAGGTC AGAGTGACC TGC TTC CTC GCT CAC TG 3′；下游引物R2：5′GTC CAG TCT CAC TGG ACA GGC AAC TAT GGA TG 3′，分子信标探针的序列为：5′FAM-CTTGG CAAGCAGCAGATTACGCCCAAG-DABCYL 3′；

(6)根据结合DNA标准曲线进行线性回归分析，得邻苯二甲酸酯浓度与Ct值关系，测定样品Ct值计算得邻苯二甲酸酯浓度。

所述步骤(1)中的KCl溶液浓度为0.15～0.2mol/L。

所述步骤(2)中的PCR扩增引物碱基序列为上游引物F1：5′CAG GTC AGA GTG ACC TGC TTC CTC GCT CAC TG 3′，下游引物F2：5′GTC CAG TCT CAC TGGACA GGC AAC TAT GGATG 3’。

所述步骤(2)中的琼脂糖凝胶质量百分比浓度为1％。

所述步骤(4)中的S1核酸酶停止液含0.3mol/L的Tris碱和1.35mol/L的EDTA。

所述步骤(5)中的分子信标荧光定量PCR扩增体系为：每50μl体系中包括含25μmol/LMgCl₂的反应缓冲液5μL、1.25mmol/L dNTP 4μL、50μmol/L上下游引物各0.2μL、TaqDNA聚合酶0.3μL、探针0.3μL、模板5μL和灭菌双蒸水35.8μL，TaqDNA聚合酶浓度为3U/μl。