[发明专利]一种分子信标荧光定量PCR检测邻苯二甲酸酯的方法

权利要求书

1.一种分子信标荧光定量PCR检测邻苯二甲酸酯的方法，包括：

(1)将喂养于含邻苯二甲酸酯的水中的鲤鱼杀死并取出肝脏，用KCl溶液洗去血液，吸干水分，加入体积与肝脏质量比为4mL∶1g的HEDG缓冲液匀浆，离心取上清，即得含有受体的细胞溶质；

(2)将pUC19质粒稀释50倍作为模板，PCR扩增制得结合DNA，将结合DNA于琼脂糖凝胶电泳分离，最后纯化回收；

(3)将邻苯二甲酸酯倍比稀释为10^-1g/L-10^-9g/L，取10μL与250μL的细胞溶质混合，于20℃振荡温育2h；

(4)从上述混合物中取20μL加入1.5mLEP管中，20℃温育15min后，再加入2μL结合DNA，继续20℃温育15min得配体-受体-DNA复合物；从复合物中取12μL再加入2μL ExoIII buffer和6μL HEDG缓冲液，混匀后37℃温育15min，再加入ExoIII100U，混匀后37℃温育15min进行初次消解；取经初步消解的溶液5μL，加入15μL S1核酸酶混合液，于37℃温育30min进行再次消解；再加入1μL S1核酸酶停止液，70℃灭活15min；得到分子信标PCR的模板；

(5)以上述模板进行分子信标荧光定量PCR扩增，分子信标PCR循环40次后在72℃延伸5min，得加入邻苯二甲酸酯浓度与起始模板拷贝数的回归方程；其中，引物碱基序列为：上游引物R1：5′CAGGTC AGAGTGACC TGC TTC CTC GCT CAC TG 3′；下游引物R2：5′GTCCAG TCT CAC TGG ACA GGC AAC TAT GGA TG 3′，分子信标探针的序列为：5′FAM-CTTGG CAAGCAGCAGATTACGCCCAAG-DABCYL 3′；

(6)根据结合DNA标准曲线进行线性回归分析，得邻苯二甲酸酯浓度与Ct值关系，测定样品Ct值计算得邻苯二甲酸酯浓度。

2.根据权利要求1所述的一种分子信标荧光定量PCR检测邻苯二甲酸酯的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的KCl溶液浓度为0.15～0.2mol/L。

3.根据权利要求1所述的一种分子信标荧光定量PCR检测邻苯二甲酸酯的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的PCR扩增引物碱基序列为上游引物F1：5′CAG GTC AGA GTG ACC TGC TTC CTC GCT CAC TG 3′，下游引物F2：5′GTC CAG TCT CAC TGG ACA GGC AAC TAT GGA TG 3′。

4.根据权利要求1所述的一种分子信标荧光定量PCR检测邻苯二甲酸酯的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的琼脂糖凝胶质量百分比浓度为1％。

5.根据权利要求1所述的一种分子信标荧光定量PCR检测邻苯二甲酸酯的方法，其特征在于：所述步骤(4)中的S1核酸酶停止液含0.3mol/L的Tris碱和1.35mol/L的EDTA。

6.根据权利要求1所述的一种分子信标荧光定量PCR检测邻苯二甲酸酯的方法，其特征在于：所述步骤(5)中的分子信标荧光定量PCR扩增体系为：每50μl体系中包括含25μmol/L MgCl₂的反应缓冲液5μL、1.25mmol/L dNTP 4μL、50μmol/L上下游引物各0.2μL、TaqDNA聚合酶0.3μL、探针0.3μL、模板5μL和灭菌双蒸水35.8μL，TaqDNA聚合酶浓度为3U/μl。

7.根据权利要求1所述的一种分子信标荧光定量PCR检测邻苯二甲酸酯的方法，其特征在于：所述步骤(5)中的分子信标PCR循环步骤为94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min。