[发明专利]一种用于乙型肝炎病毒基因耐药突变检测的试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于医学检验领域，涉及乙型肝炎病毒基因的突变耐药检测，特别涉及一种用于乙型肝炎病毒基因耐药突变检测试剂盒及检测方法。

背景技术

全世界约有三分之一的人口感染过乙肝病毒(HBV)。近些年，随着乙型肝炎疫苗计划的实施，世界范围内的乙肝表面抗原这一血清学慢性感染标志物检出率已经明显降低。但是，目前仍约有3.5亿人为慢性HBV感染者，这些患者有患慢性肝病、肝硬化和肝癌的风险。抗病毒治疗是控制和预防慢性乙肝病毒感染进展的唯一选择。

目前，我国有多种药物获批用于治疗慢性乙型肝炎。从广义上讲，这些药物可分为两类：细胞因子和核苷酸类似物。干扰素是一种自然发生的细胞因子，具有抗病毒和免疫调节的作用，也是第一种批准用于治疗慢性乙型肝炎的药物。干扰素对大约三分之一的患者有效，且需通过皮下注射进行，由于有很多的不良反应，需在治疗期间进行观察。核苷类似物针对乙肝病毒逆转录酶和乙肝病毒复制，是有效的抑制剂。他们的优势在于口服药和相对较少的不良反应。然而，他们必须长期服用才具疗效，耐药性的发生是限制其长期应用的一个主要方面。关于耐药性产生的机制和及时有效诊断的研究，对于合理的药物设计和耐药病人的管理显得尤为重要。

譬如，拉米夫定作为治疗乙肝的一线药物，具有非常好的抗病毒治疗效果。但随着治疗时间的延长，在抗病毒治疗药物的选择性压力下，对药物敏感的野生株被抑制，而耐药株因对药物不敏感而成为优势病毒株。例如服用拉米夫定治疗期间，在选择性压力下出现DNA聚合酶的酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(YMDD)基因序列变异，使其编码的204位蛋氨酸(M)突变为缬氨酸(V)或异亮氨酸(I)，即常说的YVDD和YIDD变异。这两种变异均导致拉米夫定与HBV DNA聚合酶的亲合力下降或消失，HBV对其敏感性降低上千倍。若不及时诊断并进行合理治疗，将导致治疗的失败。

然而目前只有YMDD耐药突变的实时荧光定量PCR检测技术应用于临床进行定性检测，此方法对耐药检测由于设计复杂且通量较小，并且依赖昂贵的一起，目前只能在良好的实验室条件下完成，没有快速、准确、大通量的对乙型肝炎病毒基因突变耐药检测的合适方法，对乙型肝炎的早期治疗造成了一定程度上的延误。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种用于乙型肝炎病毒基因耐药突变检测试剂盒及检测方法，以基因芯片为基础进行通量检测，实现了高特异性且快速的对乙型肝炎病毒的突变检测。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种用于乙型肝炎病毒基因耐药突变检测的试剂盒，包括用于PCR扩增乙型肝炎病毒基因耐药突变检测的P区引物对、表面固定有耐药检测探针和对照探针的固相检测阵列、包含DNA聚合酶和反应底物的固相载体上核酸扩增反应体系和显色试剂；

所述的P区引物对的5`端增加生物素标记；

所述的耐药检测探针包括针对一个或多个乙型肝炎病毒耐药突变的耐药检测探针，其长度为15～25nt，其中针对检测突变位点设置在耐药检测探针5`端5nt之后，并在耐药检测探针5`端进行减少空间位阻的序列延长修饰和/或辅助固定修饰；

所述的显色试剂包括含亲和素-碱性磷酸酶的亲和反应液和含NBT/BCIP的显色反应液。

所述的P区引物对所扩增的片段长度不超过1000bp；在检测探针上还加入PNA、LNA或硫基提高检测特异性的修饰。

所述的耐药检测探针包括以下一种或几种检测探针：

针对拉米夫定耐药突变检测位点rtL180M的乙型肝炎病毒的耐药检测探针的序列如SEQ ID NO：1所示；

针对拉米夫定耐药突变检测位点rtM204V/I的乙型肝炎病毒的耐药检测探针的序列如SEQ ID NO：2所示；

针对阿德福韦酯耐药突变检测位点rtA181V/T的乙型肝炎病毒的耐药检测探针的序列如SEQ ID NO：3所示；

针对阿德福韦酯耐药突变检测位点rtN236T的乙型肝炎病毒的耐药检测探针的序列如SEQ ID NO：4所示；

针对恩替卡韦耐药突变检测位点rtI169T的乙型肝炎病毒的耐药检测探针序列如SEQ ID NO：5所示；

针对恩替卡韦耐药突变检测位点rtS202I的乙型肝炎病毒的耐药检测探针序列如SEQ ID NO：6所示；

针对恩替卡韦耐药突变检测位点rtM250V/I的乙型肝炎病毒的耐药检测探针序列如SEQ ID NO：7所示。