[发明专利]一种用于乙型肝炎病毒基因耐药突变检测的试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种用于乙型肝炎病毒耐药突变检测试剂盒，其特征在于，包括用于PCR扩增乙型肝炎病毒基因耐药突变检测的P区引物对、表面固定有耐药检测探针和对照探针的固相检测阵列、包含DNA聚合酶和反应底物的固相载体上核酸扩增反应体系和显色试剂；

所述的P区引物对的5`端增加生物素标记；

所述的耐药检测探针包括针对一个或多个乙型肝炎病毒耐药突变的耐药检测探针，其长度为15～25nt，其中针对检测突变位点设置在耐药检测探针5`端5nt之后，并在耐药检测探针5`端进行减少空间位阻的序列延长修饰和/或辅助固定修饰；

所述的显色试剂包括含亲和素-碱性磷酸酶的亲和反应液和含NBT/BCIP的显色反应液。

2.如权利要求1所述的用于乙型肝炎病毒耐药突变检测试剂盒，其特征在于，所述的P区引物对所扩增的片段长度不超过1000bp；在检测探针上还加入PNA、LNA或硫基提高检测特异性的修饰。

3.如权利要求1所述的用于乙型肝炎病毒耐药突变检测试剂盒，其特征在于，所述的耐药检测探针包括以下一种或几种检测探针：

针对拉米夫定耐药突变检测位点rtL180M的乙型肝炎病毒的耐药检测探针的序列如SEQ ID NO：1所示；

针对拉米夫定耐药突变检测位点rtM204V/I的乙型肝炎病毒的耐药检测探针的序列如SEQ ID NO：2所示；

针对阿德福韦酯耐药突变检测位点rtA181V/T的乙型肝炎病毒的耐药检测探针的序列如SEQ ID NO：3所示；

针对阿德福韦酯耐药突变检测位点rtN236T的乙型肝炎病毒的耐药检测探针的序列如SEQ ID NO：4所示；

针对恩替卡韦耐药突变检测位点rtI169T的乙型肝炎病毒的耐药检测探针序列如SEQ ID NO：5所示；

针对恩替卡韦耐药突变检测位点rtS202I的乙型肝炎病毒的耐药检测探针序列如SEQ ID NO：6所示；

针对恩替卡韦耐药突变检测位点rtM250V/I的乙型肝炎病毒的耐药检测探针序列如SEQ ID NO：7所示。

4.如权利要求1所述的用于乙型肝炎病毒耐药突变检测试剂盒，其特征在于，所述的对照探针包括阴性对照探针和阳性对照探针，其所设计的序列均与待检测的序列无互补性，阳性对照探针的5`端还被生物素标记。

5.如权利要求1所述的用于乙型肝炎病毒耐药突变检测试剂盒，其特征在于，所述的进行减少空间位阻的序列延长修饰是在耐药检测探针5`端进行polyT、polyC、polyT+polyC或spacer 6～15C序列的延长修饰；

所述的固相检测阵列的载体为硝酸纤维素膜、尼龙膜或载玻片，耐药检测探针5`端的辅助固定修饰为在耐药检测探针5`最末端添加氨基、巯基、羟基或醛基。

6.如权利要求1所述的用于乙型肝炎病毒耐药突变检测试剂盒，其特征在于，所述的亲和反应液组成为1mL ddH₂O和2μl亲和素-碱性磷酸酶液；显色反应液组成为1mL显色缓冲液、6.5μlNBT和3.5μl BCIP。

7.一种基于权利要求1所述的检测试剂盒的乙型肝炎病毒耐药突变检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)以包含待测乙型肝炎病毒基因组的DNA为模板，以引物对为扩增引物，进行多个循环的PCR扩增，得到PCR扩增产物；

2)将PCR扩增产物进行变性处理后，置于固相载体上核酸扩增反应体系中，然后再加入固相检测阵列，进行固相核酸扩增反应；其反应程序为：A：在不低于探针Tm值5℃的温度下退火至少10s；B：72℃延伸至少10s；A-B循环数至少大于1；最后72℃延伸至少3min；

3)固相核酸扩增完成后，取出固相检测阵列放入洗脱液中离心洗脱，去除非特异核酸的结合，用亲和反应液覆盖固相检测阵列并进行孵育，再次洗脱后用ddH₂O冲洗，最后覆盖包含NBT和BCIP的显色反应液进行显色，直至看到显色斑点后用ddH₂O终止反应；

4)显色斑点所对应的检测结果即为所检测的乙型肝炎病毒基因野生型检测位点并未发生突变，根据显色斑点与突变检测探针所针对的基因突变位点，判定乙型肝炎病毒突变情况。