[发明专利]用双指示线免疫层析半定量诊断甲胎蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物工程技术领域的检测方法，具体是一种用双指示线免疫层析半定量诊断甲胎蛋白的方法。

背景技术

肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一，是死亡率仅次于胃癌、食道癌的第三大常见恶性肿瘤。肝癌恶性程度高，发展迅速，其平均患病年龄为44岁，若治疗不及时或治疗方案选择不当，平均生存时间为半年。我国每年死于肝癌约11万人，占全世界肝癌死亡人数的45％，但随着AFP及其他检测方法的广泛应用，肝癌的发病率和检出率逐渐增高。这表明，未来我国对于高质量的肝癌诊断产品，尤其是AFP诊断产品的需求将越来越大。

对于肝癌来说，一般自身如果出现明显症状，再去检查的话就已经到了晚期，而且错过了最好的治疗时间。肝癌病人早期基本上无症状，一旦出现诸如肝区疼痛、腹胀、腹部包块、黄疸、腹水等症状时，多已属晚期。肝癌患者很难早期发现，目前接受治疗的肝癌病人约3/4就属于晚期，给治疗带来极大的困难。，患者会感到肝区胀痛，尤其饭后为甚，厌食，肝大，右上腹有肿块，不明原因的消瘦、腹胀、腹泻、间断性发热、乏力、食欲减退等。因此，早期发现并及时就诊成为提高肝癌治愈率的焦点问题，而目前，对于肝癌的早期检测集中于甲胎蛋白AFP这一特异性蛋白。

甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)是一种由胎儿肝细胞产生的分子量70kDa左右的胚胎性糖蛋白，出生后其含量在20ng/mL以下，一旦肝细胞发生癌变，则恢复了产生这种蛋白质的功能，血液中AFP含量明显增高，所以可作为诊断原发性肝癌的指标之一。一般认为AFP含量低于20ng/mL时，没有临床意义，大于20ng/mL而小于400ng/mL时，可视为肝细胞异常，在400ng/mL以上时，作为原发性肝癌的确诊指标。因此，检测血清中AFP含量的异常增高，作为早期发现和诊断原发性肝癌，在临床上是非常有效的判定依据。血清中AFP含量不仅可作为HCC的早期诊断指标，也可作为疗效观察和预后判断的指标。目前，临床上常用的AFP检测的方法为ELISA，CLIA等方法。上述方法费时、费力、不利于普及而且费用昂贵。开发简单、快速的肝癌早期诊断方法具有十分重要的经济价值和社会意义。

免疫胶体金技术是20世纪70年代初期由Faulk和Taylor始创，最初用于免疫电镜技术。胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物或显色剂，于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术，现在已成功用于电镜、流式细胞仪、免疫印迹、蛋白染色、体外诊断制剂的制造等领q域。目前金标记技术常与膜载体配合，形成特定的免疫检测方式，如免疫渗滤试验和免疫层析试验等。免疫层析试纸条就是此技术用于体外快速诊断的一个重要发展方向，是在现代单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的新型检测技术。近年来该技术发展迅速，已经在临床诊断特别是床边检测(POCT)中得到了广泛应用，如传染病、早孕、癌症等的检测。

目前，已经有很多公司开发出检测甲胎蛋白的试剂盒，例如蓝十字生物药业(北京)有限公司的甲胎蛋白(AFP)检测试纸(胶体金法)，重庆泰科华谊医药有限公司的甲胎蛋白AFP胶体金诊断试剂等。侯惠仁等人通过实验研制AFP免疫层析测试条，只需将少量血清滴于测试条上，大约10min后，经目测即能得知AFP的阴阳性。但是对于临床上肝细胞的异常及肝癌不能区分，单独使用20ng/mL这一标准不能直接、快速确诊肝癌，所以开发能够检测AFP 20～400ng/mL这一AFP诊断灰区的半定量胶体金试纸也是十分必要的。目前国内外均无相关的试纸条出售。

发明内容

本发明的目的：开发简单、快速的甲胎蛋白诊断方法具有十分重要的经济价值和社会价值。本实验采用胶体金免疫层析法，建立快速检测AFP的方法。并且能够半定量检测20ng/mL～400ng/mL这一AFP灰区范围。

本发明是通过以下技术方案实现的：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，标记抗AFP单克隆抗体1并均匀涂布于胶金垫上，作为示踪标记物。在硝酸纤维素膜上，两个不同浓度的AFP单克隆抗体2固定于两个检测线(即T线)，羊抗鼠二抗固定于质控线(即C线)。依次将样本垫、胶金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸组装，剪成胶体金试纸并装入检测卡中。金标抗体与相应的抗原、抗体发生特异性结合被截留而显色，根据T线、C线显色与否来判断阴阳性结果。

本发明方法包括如下步骤：

一、胶体金溶液配制

1.配制1％氯金酸溶液；

2.配制2％柠檬酸三钠溶液；