[发明专利]VKORC1基因的第-1639位碱基的多态性检测方法、以及用于该方法的核酸探针和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及VKORC1基因的第-1639位碱基的多态性检测方法、以及用于该方法的核酸探针和试剂盒。

背景技术

对于心肌梗塞、脑梗塞患者，广泛使用华法林(warfarin)作为防止血液凝固的药物。华法林的适用量根据人种而有大的差异，进而，即便是相同人种，个体间也显示出差异。若过量投与华法林，则有可能发生例如鼻出血、皮肤内出血，或者有时还会发生颅内出血等副作用。因此，在治疗中对各个患者分别确定华法林的适当用量变得极为重要。

在确定这样的华法林的适用量值之际，近年来，有报道称：CYP2C9基因和VKORC1基因的多态性关系到华法林的药效(非专利文献1、2)。CYP2C9基因是编码用于制备华法林代谢酶的细胞色素P450的基因。VKORC1基因是编码作用于维生素K的蛋白质的基因，该维生素K参与血液的凝固。因此，检测出这两种基因的多态性对于相应于患者来确定华法林的适用量、并减少副作用而言也是非常重要的。另外，作为VKORC1基因的多态性，已知1173C＞T(rs9934438)、-1639G＞A(rs9923231)等。这些VKORC1基因的多态性记载于非专利文献3～5中。

作为检测碱基的多态性的方法，有PCR-RFLP法(聚合酶链-限制性长度多态性分析)(非专利文献3)或利用焦磷酸测序(pyrosequencing)技术来检测突变的方法(非专利文献4)。

然而，非专利文献3的PCR-RFLP法需要花费功夫和成本，例如在进行DNA的提取纯化和PCR后，需要对扩增产物进行限制酶处理、进行电泳等。另外，由于在进行PCR后需要进行扩增产物的处理，因此有扩增产物混入下一反应体系之虞，存在难以自动化、无法同时检测多个核酸序列的问题。

非专利文献4的焦磷酸测序是基于如下原理的，即，通过将核苷酸被引入DNA时所释放的焦磷酸转变成ATP来用于发光反应，从而能够定量有多少核苷酸被引入DNA中。实际上，是通过每次加入一种脱氧核糖核苷酸测定发光量后将之除去并重复进行这种操作，从而确定序列的。作为除去过剩核苷酸的方法，有固相化法，其将模板DNA结合到某些固相基质上，通过用反应液冲洗来除去过剩核苷酸；和液相法，其通过加入腺苷三磷酸双磷酶(apyrase)来分解核苷酸。虽然有自动进行这些繁杂作业的系统在售，但价格非常昂贵，需要成本。另外，存在必须进行DNA的提取纯化、前处理等，需要花费功夫和成本的问题。

另一方面，已知有：通过PCR(聚合酶链反应)对包含突变的区域进行扩增后，使用荧光染料标记的核酸探针进行融解曲线分析，并基于融解曲线分析的结果来解析突变的方法(专利文献1、2)。然而，在这些文献中，关于探针的设计仅有如下教导，即，应将探针设计成：当使末端部被荧光染料记的淬灭探针与目标核酸杂交时，在末端部，探针-核酸杂交体的多个碱基对至少形成一个G-C对(pair)。

专利文献3中记载有，使用5’末端荧光标记的探针，通过融解曲线分析来同时检测VKORC1 1173C＞T(rs9934438)和CYP2C9*3的方法。但是，并没有记载检测VKORC1-1639G＞A(rs9923231)的多态性的方法。另外，也没有记载同时检测VKORC1-1639G＞A(rs9923231)的多态性和CYP2C9*3突变位点的多态性的方法。

现有技术文献：

专利文献：

专利文献1：日本特开2001-286300号公报

专利文献2：日本特开2002-119291号公报

专利文献3：国际公开公报WO/2008/117782

非专利文献1：Simone Rost et al.，Nature Vol.427 2004letters to nature

非专利文献2：Mark J.Rieder et al.，The New England Journal of Medicine 352；22，2005

非专利文献3：TDM研究Vol.25 No.4(2008)141-144

非专利文献4：BLOOD，1 SEPTEMBER 2007 VOLUME 110，NUMBER 5

非专利文献5：Genet Med.2008 Feb；10(2)：89-98

发明内容。

发明要解决的问题