[发明专利]人类乳头瘤病毒核酸基因扩增和分型的方法以及用于该方法的检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及人类乳头瘤病毒核酸基因的扩增和分型方法，以及用于该方法的检测试剂盒。 

背景技术

人类乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)能引发尖锐湿疣和宫颈癌，是目前除艾滋病外对患者的身心健康影响最大的性传播疾病。目前已发现了超过100种以上的HPV基因型，可分为皮肤型HPV和生殖道上皮型HPV。依据与生殖道肿瘤相关与否可将生殖道上皮HPV分为高危型HPV(例如HPV-16亚型和HPV-18亚型等)和低危型HPV(例如HPV-6亚型和HPV-11亚型等)，高危型HPV与子宫颈癌及子宫颈上皮内瘤变(CIN2/3)的发生相关，低危型HPV常引起外生殖道湿疣等量性病变。 

HPV的检测和分型方法主要有杂交法和以聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)为基础的检测方法两大类。 

美国Digene公司开发的杂交捕获法(Hybrid Capture，HC)HPV核酸检测技术，是将HPV DNA双链裂解为单链后与RNA探针结合成RNA-DNA杂交体，并被特异性抗体固定在试管壁或微孔壁上，结合有碱性磷酸酶的多个第二抗体与RNA-DNA杂交体结合，其标记物碱性磷酸酶使酶底物发光，光的强弱对应于碱性磷酸酶的含量，从而确定RNA-DNA杂交体的含量，进而确定样本中HPV病毒的拷贝数。目前商品化的杂交捕获法二代技术(HC-II)是第一个通过FDA批准的可在临床使用的HPV DNA检测技术，可检测18种HPV，其中包括13种高危型HPV(-16、-18、-31、-33、-35、-39、-45、-51、-52、 -56、-58、-59、-68)和5种低危型HPV(-6、-11、-42、-43、-44)。HC-II法是一种测定病毒负荷量的半定量方法，用实时荧光定量PCR测定其中的HPV-16的值与HC-II的值相吻合(J Clin Virol，2004，31(2)：140-147)。目前美国食品药品管理局(the Food and DrugAdministration，FDA)推荐的阳性结果的临界值是1.0RLU(相对光单位)，相当于每1ml样本缓冲液中有1pg HPV DNA(或100,000HPV拷贝/ml)。该技术敏感性较好，重复性高。但HC-II使用混合探针，不能对HPV进行分型，是这项检测技术的最大缺点。除此之外，HC-II作为杂交技术，存在交叉杂交的问题，即与不在混合探针中的其他HPV亚型起交叉反应引起假阳性结果而降低特异性(Am J ObstetGynecol，2004，191(3)：757-761)。 

以PCR为基础的检测方法是先用PCR方法先进行病毒基因的扩增，然后再利用各种方法进行检测。对HPV的基因扩增主要可以分为型特异PCR和普通的通用引物PCR。型特异PCR是用型特异PCR引物，针对型间变异最大的区域(通常是HPV基因组的E5/E7区)设计成能特定扩增单个HPV基因型。用型特异性PCR后即可确定特定型别的HPV，但这种方法费力，为了检测一个临床样本中HPV DNA的存在，需要分别完成多个型特异的PCR反应。通用引物PCR是用通用引物，针对不同HPV型别之间的保守区域(通常是HPV基因组的L1区)来扩增广谱的HPV。用普通PCR进行扩增后对阳性的扩增产物就可以用各种方法进行HPV的分型检测。 

PCR产物的分型检测主要有直接测序法、限制性片段长度多态性分析、杂交法以及基因芯片法。由于样本病毒DNA经过PCR扩增，其灵敏度较普通杂交法显著提高。直接测序法对检测少见型和发现新的型别有着重要的作用(J Med Microbiol，2004，53(Pt 2)：125-128)，但对于混合感染中同步检测不同序列的敏感性不高，而且费时、昂贵。PCR产物的限制性片段长度多态性分析(PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)通过选择内切酶的最佳组合可以检测HPV的具体型别，特别是可以检测出HC-II所不包含的罕见型别(J Med Virol，2003，71(1)：110-114)，但RFLP对PCR产物的特异性要求比较高，需要优化PCR反应条件，增加目的条带的特异性。PCR产物的杂交分析缺点是不能排除杂交固有的问题，即交叉杂交存在的可能性。基因芯片对HPV的敏感性(96.0％)高于细胞学的敏感性(83.6％)(Cancer，2003，97(7)：1672-1680)，对HPV的分型检测有广阔的发展前景，但目前的基因芯片技术成本昂贵，检测的可靠性、实用性还有待于验证。