[发明专利]一种改造大肠杆菌产维生素C前体2-酮基-L-古龙酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种高产2-KLG的大肠杆菌工程菌及其构建方法，采用分子手段引入SLDH、SDH/SNDH和辅酶PQQ，从而实现代谢山梨糖生产2-KLG，属于遗传工程领域。

背景技术

维生素C是一种重要的有机酸，广泛应用于制药、食品、饮料、化妆品和饲料等工业中，2-KLG是合成维生素C的重要前体。目前国内维生素C工业化生产采用二步发酵法，以D-山梨醇为底物的二步发酵法是研究得最早、也是研究得最多最深入的生产方法。在这一过程中，氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)转化D-山梨醇为L-山梨糖，L-山梨糖转变为2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonic acid，2-KLG)的过程是由一个混菌系统完成的，这一混菌发酵系统由巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium，俗称大菌)和普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare，俗称小菌)组成，其中K.vulgare为产酸菌，单独培养时生长微弱，产酸较少；B.megaterium为伴生菌，不产酸，但促进K.vulgare生长或产酸。尽管目前国内维生素C工业化生产所采用的二步发酵工艺具有生产周期短、成本低廉等优点，但同时也存在一些问题，如：(1)能耗物耗较高、成本高；(2)废气、废水和废渣三废排放量大；(3)工艺复杂、产品创新品种较少等，制约了维生素C产业的进一步发展。如何简化发酵工艺是一个迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种高产2-KLG的E.coli工程菌。

所述工程菌含有sldh、sdh/sndh、pqq基因。

所述sldh、sdh/sndh、pqq基因核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3所示。

所述sldh、sdh/sndh、pqq基因克隆于pET28a(+)表达质粒上。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种高产2-KLG的E.coli基因工程菌的构建方法。

为解决上述技术问题，本发明的具体方案为：

1)分别设计引物克隆Gluconobacter oxydans ATCC 621H的sldh基因和pqq基因；根据本实验室对K.vulgare DSM4205的全基因组测序结果中注释的sdh/sndh基因序列设计引物克隆sdh/sndh基因；

2)将sldh、sdh/sndh、pqq基因与载体连接得到重组表达载体；

3)将得到的重组表达载体转化大肠杆菌(Escherichia coli)后得到重组菌株。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种发酵生产2-KLG的方法，工程菌种子培养后，按10％比例接种5L发酵罐，发酵16h后，流加量碳源2.5g/L.h，发酵参数：转速500rpm，pH 5.1～5.4，通气量1.5vvm，控制罐温30℃，罐压0.05MPa，发酵罐溶氧反弹到20％-30％时添加IPTG至终浓度0.5mM。

种子和斜面培养基(g/L)：酵母膏5，蛋白胨10，氯化钠10；琼脂20(斜面培养基)，pH 7.0，121℃灭菌15min，卡那霉素终浓度50μg/mL。

发酵培养基(g/L)：山梨糖80，蛋白胨12，酵母提取物24，甘油4ml，磷酸二氢钾2.31，磷酸氢二钾12.54，pH 7.0，121℃灭菌15min，卡那霉素终浓度50μg/mL，IPTG终浓度0.5mM。

山梨醇、2-KLG含量测定：液相色谱(LC)

发酵样品用流动相十倍稀释，0.45μm滤膜过滤。Agilent 1100 system，RioRad公司Aminex HPX-87H色谱柱；流动相：2.75μmol/L浓硫酸；柱温：35℃；流速：0.6mL/min；进样量：5μL；检测器：示差折光检测器。

本发明通过基因工程改造，将来源于氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)的sldh和pqq基因簇及来源于普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)的sdh/sndh基因表达于大肠杆菌(Escherichia coli)中，获得了一株利用山梨醇生产2-KLG的E.coli工程菌。采用E.coli工程菌利用山梨醇发酵生产2-KLG工艺简单，2-KLG的产量可达87g/L，具有很好的应用前景。本发明提供的构建方法简单，适于标准化。

具体实施方式

实施例1表达载体的构建