[发明专利]检测曲妥珠影响MCF-7细胞中Trx-1蛋白表达的方法

权利要求书

1.检测曲妥珠影响MCF-7细胞中Trx-1蛋白表达的方法，包括用四噻唑蓝(MTT)法测定MCF-7细胞的存活率和曲妥珠降低MCF-7细胞中Trx-1蛋白表达水平检测步骤，所述四噻唑蓝MTT法测定MCF-7细胞的存活率是用MCF-7细胞株的培养，MCF-7细胞的排板，梯度浓度曲妥株刺激，四噻唑蓝MTT试验来进行；所述曲妥珠降低MCF-7细胞中Trx-1蛋白表达水平检测步骤是用细胞株培养和曲妥珠刺激处理，免疫印迹步骤来进行。

2.根据权利要求1所述的检测曲妥珠影响MCF-7细胞中Trx-1蛋白表达的方法，其特征在于所述四噻唑蓝MTT法测定MCF-7细胞的存活率中用MCF-7细胞株的培养步骤是用MCF-7细胞用含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI1640培养基，于37℃、5％CO₂和95％湿度下进行贴壁培养。每2-3天更换培养基一次，细胞达约70％～80％融合时，传代或用于实验；MCF-7细胞的排板用0.25％的胰酶将贴壁的MCF-7细胞消化起来，1500rpm离心5min，除去胰酶。将细胞均匀排在96孔板中，排板密度为1×10⁴cell/孔，在含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI1640培养基，于37℃、5％CO₂和95％湿度下进行贴壁培养；梯度浓度曲妥株刺激采用细胞培养过夜，换新鲜RPMI1640培养基，对照组不加曲妥株，实验组分别用50、100、150和200μg/ml的浓度曲妥珠刺激，各组设5个平行实验；四噻唑蓝MTT试验是取出待测的96孔细胞培养板，每孔加5mg/ml MTT溶液10ul，继续孵育4小时后，3000rpm室温下离心15min，小心去掉上清，每孔加入150μl二甲基亚砜，小心混匀，用酶标仪在波长570nm处测定吸光度值。

3.根据权利要求1所述的检测曲妥珠影响MCF-7细胞中Trx-1蛋白表达的方法，其特征在于所述曲妥珠降低MCF-7细胞中Trx-1蛋白表达水平检测步骤细胞株培养和曲妥珠刺激处理是将MCF-7细胞用含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的1640培养基，于37℃、5％CO2和95％湿度下进行贴壁培养，每2-3天更换培养基一次，细胞达约70％～80％融合时，传代或用于实验；将细胞接种于平板中，培养过夜后，曲妥珠处理细胞，分组处理如下：对照组不加药，实验组分别加50、75、100、150和200μg/ml的浓度曲妥珠刺激；上述处理后，置于37℃和5％CO2培养箱中培养24小时，然后收集细胞，以提取蛋白：1500rpm离心5min收获细胞，分别加入100μl含150mM NaCl，0.5％NP-40，10mM Tris-HCl，pH 7.2，0.1mM PMSF，2μg/ml aprotinin，200μg/ml NaN₃的细胞裂解液，充分混悬后于冰溶下放置裂解50min，中间振荡5～6次，4℃下15000rpm离心15min，转上清至新离心管中，-80℃保存；所述免疫印迹包括蛋白含量的测定和蛋白免疫印迹，蛋白含量测定用BCA试剂盒测定：将10μl标准品或待测样本与200μl工作溶液混合，37℃孵育30min，将反应管温度冷却至室温，测定562nm光密度值，绘制标准曲线，并计算蛋白浓度；蛋白免疫印迹用总蛋白加样量为6和20μg，与2×SDS凝胶加样缓冲液混合后，95℃热变性5min，用15％的SDS-PAGE胶电泳分离后，将蛋白条带用电转移到PVDF膜上，用5％脱脂牛奶4℃封闭过夜；取出PVDF膜，用含0.1％Tween-20的TPBS冲洗后，加入1000倍稀释的一抗室温孵育75min；用含0.1％Tween-20的TPBS冲洗，加入5000倍稀释的二抗室温孵育75min；用含0.1％Tween-20的TPBS冲洗，将PVDF膜浸入发光底物溶液中反应1min，X射线胶片曝光。

4.根据权利要求1所述的检测曲妥珠影响MCF-7细胞中Trx-1蛋白表达的方法，其特征在于硫氧还蛋白-1是曲妥珠的作用靶点。