[发明专利]用于鉴定芽孢杆菌的通用引物以及使用它们的分类方法

说明书

技术领域

本发明属于芽孢杆菌鉴定分类方法。具体涉及用于鉴定芽孢杆菌的通用引物，以及利用它们对芽孢杆菌进行分类鉴定的方法

背景技术

芽孢杆菌(Bacillus)是一类广泛存在于自然界、能形成芽孢的革兰氏阳性细菌。不同种类的芽孢杆菌对人类的作用是不同的，有些是有益的，如某些枯草芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌可以产生用于作物病害生物防治的抑真菌物质，地衣芽胞杆菌可以产生工业所需的酶类，苏云金芽孢杆菌(BT)可以产生可作为微生物杀虫剂的毒性蛋白。而有些则是有害的，如炭疽芽胞杆菌能引起人类致死的炭疽病；蜡样芽孢杆菌可以污染食品从而引起人类腹泻。因此，在应用之前对于芽孢杆菌进行准确分类十分重要。

芽孢杆菌属(Bacillus)中的有些种之间亲缘关系较近，形态特征相似，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，萎缩芽孢杆菌(B.atrophaeus)，解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)，地衣芽胞杆菌(B.licheniformis)，短小芽孢杆菌(B.pumilus)，巨大芽孢杆菌(B.megaterium)，坚强芽孢杆菌(B.firmus)，蜡样芽孢杆菌(B.cereus)，苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)或炭疽芽胞杆菌(B.anthracis)等(Porwal等.PLoS One2009(4)，4438)，利用现有方法有时难以进行准确区分。

芽孢杆菌的分类鉴定方法主要有：(1)形态和生理生化方法，此种方法因不同芽孢杆菌种之间形态和生理生化特征比较相似而难以对它们进行区分，存在准确度不高、费时费力等缺点(Ash，C等.Letters in Applied Microbiology.1991.13，202-206)。(2)16S rDNA序列对比方法，由于不同种的芽孢杆菌之间16S rDNA序列相似性极高(＞98％)，对有些芽孢杆菌很难进行准确地归类。(3)RAPD和AFLP扩增标记对比方法，此方法均存在操作复杂或分类结果不准确的缺点(Levy，H.等.(2010).The Challenge of Highly PathogenicMicroorganisms 191-198.Tourasse，N.J.等.(2010).FoodMicrobiology)。(4)利用gyrA、gyrB或rpoD基因等芽孢杆菌中普遍存在的、序列变异程度较高的基因进行鉴定分类(Chelo，I.M.等.International journal of systematicand evolutionary microbiology.2007.57，276。Meintanis，C.等.Letters in applied microbiology.2008.46，395-401)。其中gyrB基因已被广泛地用于芽孢杆菌的系统发育分析和菌株鉴定(Bavykin，S.G.等.Journal of Clinical Microbiology.2004.42，3711)，但该基因不能准确地将苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)和蜡样芽孢杆菌区分(B.cereus)(Wang，L.T.等.International journal of systematic and evolutionarymicrobiology.2007.57，1846)。从上述可知，到目前为止，还没有一种能将所有的芽孢杆菌种区分的方法，导致有些芽孢杆菌种之间难以区分，限制了有益芽孢杆菌的应用或对有害芽孢杆菌缺少明确的认识。

phoR和phoP(亦表示为：phoP/phoR)是芽孢杆菌中普遍存在的一个双因子调控系统，其中phoR基因全长1737bp，编码一种组氨酸蛋白激酶，phoP基因全长720bp，编码一种受体蛋白，两个基因之间存在8bp的重叠序列。在低磷环境下，phoR自身磷酸化并且将获得的磷酸基团转移到phoP上，磷酸化的phoP调控下游基因的表达。

发明内容

本发明人从枯草芽孢杆菌NCD-2菌株中克隆出phoP和phoR基因，在进行序列比对时意外发现，在芽孢杆菌属内不同种的菌株之间phoP/phoR双因子调控系统基因序列(指phoP和phoR两个基因的全序列)存在较高的变异性，因此，本发明人提出将phoP/phoR双因子调控系统内部的部分核苷酸序列用于芽孢杆菌的鉴定分类，本发明中用“phoPR”或“phoPR基因”来表示所述的phoP/phoR双因子调控系统的部分核苷酸序列。

本发明目的在于提供一种用于鉴定芽孢杆菌的基因扩增通用引物。