[发明专利]用于鉴定芽孢杆菌的通用引物以及使用它们的分类方法

权利要求书

1.用于鉴定芽孢杆菌的基因扩增通用引物，其特征在于所述的通用引物由上游简并引物和下游简并引物组成，所述的上游简并引物由SEQ ID No：1所示的核苷酸序列组成，所述的下游简并引物由SEQ ID No：2所示的核苷酸序列组成。

2.利用权利要求1所述的通用引物对芽孢杆菌进行分类鉴定的方法，按照如下步骤进行：

(1)以待测菌株的基因组DNA为模板，以上游简并引物和下游简并引物为引物进行PCR扩增，对扩增所得的DNA片段进行回收、纯化、测序，得phoPR基因序列；其中所述的上游简并引物由SEQ ID No：1所示的核苷酸序列组成，所述的下游简并引物由SEQ ID No：2所示的核苷酸序列组成；

(2)将步骤(1)测序所得待测菌株的phoPR基因的核苷酸序列与GeneBank数据库中所有芽孢杆菌的phoP/phoR基因的核苷酸序列进行序列比对，序列比对结果中与待测菌株序列相似性最高的菌株所属的种，即为该菌株所属的种。

3.按照权利要求2所述的分类鉴定的方法，其特征在于其步骤(2)中所述的序列比对是将扩增所得的待测菌株的phoPR基因序列与GenBank数据库中所有的芽孢杆菌的phoP/phoR基因序列通过BLAST进行序列比对；对比结果中与待测菌株序列相似性最高的芽孢杆菌菌株所属的种，即为该菌株所属的芽孢杆菌的种。

4.利用权利要求1所述的通用引物对芽孢杆菌进行分类鉴定的方法，按照如下步骤进行：

(1)以待测菌株的基因组DNA为模板，以上游简并引物和下游简并引物为引物进行PCR扩增，对扩增所得的DNA片段进行回收、纯化、测序，得phoPR基因序列；其中所述的上游简并引物由SEQ ID No：1所示的核苷酸序列组成，所述的下游简并引物由SEQ ID No：2所示的核苷酸序列组成；

(2)利用Clustal X软件对2个以上的未知菌株的phoPR基因序列进行多重序列比对，比对过程中同时加入不同种的标准菌株的phoPR基因序列；然后利用MEGA软件构建系统发育树，在系统发育树中与待测菌株亲缘关系最近的标准菌株所对应的种，即为该菌株所属的种。

5.按照权利要求2、3或4所述的分类鉴定的方法，其特征在于其步骤(1)中所述的PCR扩增的反应体系为：10×Buffer 5μl，dNTPs 8μl，phoPR-F1μl，phoPR-R 1μl，待测菌株基因组DNA 1μl，rTaq DNA聚合酶1μl，ddH₂O33μl；共50μl。

6.按照权利要求5所述的分类鉴定的方法，其特征在于其步骤(1)中所述的PCR扩增的反应条件为：95℃ 5min；94℃ 45s，48℃ 45s，72℃ 1min，共35个循环；72℃ 10min。

7.一种芽孢杆菌分类鉴定试剂盒，其特征在于含有由SEQ ID No：1和SEQID No：2所示的核苷酸序列组成的基因扩增通用引物。

8.按照权利要求7所述的芽孢杆菌分类鉴定试剂盒，其特征在于还包括dNTPs、10×Buffer、rTaq DNA聚合酶和超纯水。