[发明专利]用肠杆菌SY-8发酵生产铁型超氧化物歧化酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物酶，尤其是涉及一种用阴沟肠杆菌SY-8发酵生产铁型超氧化物歧化酶(Fe-SOD)的方法。

背景技术

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase)简称SOD，是一种广泛存在于自然界的生物酶，具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的重要物质。1930年，由Keilin和Mann发现SOD。当时，他们仅认为是一种蛋白质，并命名为血铜蛋白。1968年，美国生化专家Fridovich和Mccord从牛红细胞中提取出SOD，并报告SOD有清除自由基的作用。罗伯·佛契哥特、费瑞·慕拉德和路伊格纳洛3位美国科学家共同发现自由基所引起的各种分子结构和性质的改变，并指出SOD是以自由基为底物的生物酶，是人体内重要的自由基清除剂。因此1998年度的诺贝尔生理医学奖授予他们。现人们已从动物、植物和微生物等各种生物体内分离得到SOD。按所含金属种类不同SOD可分为Cu，Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD和Ni-SOD4种。

现在市场上出售的SOD大多都从血液中提取，属于Cu，Zn-SOD。其分子由两个亚基组成，每个亚基含有一个铜离子和一个锌离子，分子量在32000左右。由于从动物血液中提取SOD，难以消除各种病毒及外源污染，因此从动物血液中提取Cu，Zn-SOD有很大的风险。欧盟已于1999年颁布法令，禁止从动物血液中提取的SOD用于人类。尽管目前欧盟之外的国家和地区尚无类似规定，但用其他更安全的、更经济的提取或合成方法取代从动物血液中提取SOD，将是一个趋势。从植物中提取SOD也有其明显的局限性，如植物生长周期长，植物的栽培受到季节和地域限制也很大，因此从微生物中获得SOD的研究在国内外兴起。

目前，美国、日本和加拿大等国已经开始采用微生物菌种及基因重组等生物工程技术来获得SOD。我国也有从微生物提取SOD的报道。例如，王岁楼等(王岁楼.等，工业微生物，1997，27(2)：45-47)报道用甲笨破壁法从耐高温酒精活性干酵母中提取SOD，在初步优化的提取条件下SOD产量可达1097U/g。杨明琰等(杨明琰.等，食品科学，2005，26(2)：159-161)从酿酒酵母BUV094发酵液中提取得到的SOD，其比活为1015U/mg。从当前报道看，微生物生产SOD产量都不高，这不利于工业化生产，因此获得高产的菌种及其稳定培养的方法是工业化大生产的基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用阴沟肠杆菌SY-8发酵生产铁型超氧化物歧化酶的方法。

本发明所采用的菌株是从福建省武夷山保护区土壤中分离出的革兰氏阴性细菌，该菌为革兰阴性粗短杆菌，宽约0.6～1.1μm，长约1.2～3.0μm，周身鞭毛，无芽孢无荚膜，兼性厌氧，在LB培养基上就能生长形成大而湿润的黏液状菌落。鉴定该菌株为阴沟肠杆菌SY-8(Enterobacter cloacae SY-8)，该菌株已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2011年02月28日，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.4622。

所述用阴沟肠杆菌SY-8发酵生产铁型超氧化物歧化酶的方法包括以下步骤：

1)取液氮保藏的菌株阴沟肠杆菌SY-8，接入装有LB培养基的三角瓶中振荡培养，使菌株复苏；

在步骤1)中，所述菌株与LB培养基的体积比可为1∶(10～200)，最好为1∶100；所述LB培养基的组成为每升LB培养基中含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，pH＝7.2；所述振荡培养的条件可为：温度为28～37℃，最好为30℃，置于150～240r/min，最好为200r/min的摇床中振荡培养。

2)将复苏后的菌液转接入发酵罐中的LB培养基中发酵培养，并加入诱导剂，诱导培养后，即可获得发酵液；

在步骤2)中，所述复苏后的菌液的体积百分比用量可为LB培养基的1％～10％；所述发酵培养的温度可为28～37℃，发酵培养的时间可为16～24h；所述诱导剂可采用Fe3+或H2O2，所述Fe3+的浓度可为100～500mg/L，所述H2O2的体积比可为1％～5％；所述诱导培养的时间可为24～48h。