[发明专利]新生儿神经管畸形致病基因突变检测试剂盒及应用

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及检测新生儿神经管畸形致病基因是否发生突变的试剂盒。

背景技术

叶酸是机体所需的重要营养素，为水溶性B族维生素，在绿叶蔬菜、水果及动物肝脏中含量丰富。叶酸在人体内以四氢叶酸的形式起作用，四氢叶酸是一碳单位的运载体，可运载甲基、甲烯基、甲醛基等一碳单位，参与体内氨基酸、嘌呤、嘧啶的合成。因而叶酸对细胞分裂增殖、组织修复和机体发育等都是不可缺少的营养素。

对于孕妇，补充叶酸尤其重要。妊娠头4周是胎儿神经管分化和形成的重要时期，此期叶酸缺乏可增加胎儿神经管畸形及早产的风险，而很多受孕者在早孕期并没意识到自己已经怀孕；更有研究显示，妇女在服用叶酸4周后，体内叶酸缺乏的状态才能得到明显的改善。因此，育龄妇女至少应在孕前3个月开始，适当多吃富含叶酸的食物和补充叶酸，以确保胚胎早期有一个较好的叶酸营养状态，预防胎儿神经管及其他器官畸形的发生。

育龄妇女服用叶酸增补剂时由于个人的遗传体质不同，存在叶酸代谢能力的差异，不同人群所需叶酸剂量不能一概而论。如服用剂量不足实际需求，达不到补充叶酸的效果；而盲目过量服用高浓度叶酸，会干扰孕妇的营养元素代谢，同样会影响胎儿发育，超量服用叶酸也会引起药品不良反应，反而会对孕妇和胎儿造成严重不良后果。所以不同身体状况与素质的育龄妇女必须根据自身情况，有的放矢地准备与补充所需要的叶酸。

目前，经证实并且机理研究清楚的与叶酸代谢密切相关的基因有：5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶还原酶基因(MTRR)。

MTHFR为5，10-methylenetetrahydrofolate reductase(NADPH)(亚甲基四氢叶酸还原酶)蛋白编码基因，主要作用是在叶酸代谢通路中将5，10-亚甲基四氢叶酸转化为具有生物学功能的5-甲基四氢叶酸盐。5-甲基四氢叶酸盐可以进一步进入甲基传递通路，通过同型半胱氨酸的重新甲基化过程间接的为DNA甲基化和蛋白质甲基化提供甲基并且使血液中的同型半胱氨酸量保持在一个较低的水平。研究发现，MTHFR基因存在多种多态型，影响MTHFR活性和热稳定性。常见的变异包括：(1)677C-T：MTHFR基因第677位密码子胞嘧啶(C)被胸腺嘧啶(T)替代，编码后酶分子中丙氨酸被缬氨酸替代，引起MTHFR热稳定性和活性降低，相对于正常的C/C基因型，纯合子T/T基因型MTHFR活性在37摄氏度降低50％～60％，在46摄氏度降低65％；(2)1298A-C：编码后酶分子中谷氨酸被丙氨酸替代，引起MTHFR活性降低。1298A-C与677C-T不同的是，纯合子和杂合子血浆同型半胱氨酸升高和叶酸降低均不明显。然而，如果同时存在1298A-C和677C-T复合变异的杂合子，则MTHFR活性低于野生型40％。

甲硫氨酸是蛋白质合成和一碳代谢的必需氨基酸，它的合成是由甲硫氨酸合酶(MTR编码)催化的，而甲硫氨酸合酶因为辅助因子维生素B12被氧化而最终失活。MTRR编码的甲硫氨酸合成酶还原酶能够通过还原型甲基化作用重新生成具有功能活性的甲硫氨酸合酶。MTRR能够保持甲基钴铵III在一定水平，而甲基钴铵III是激活蛋氨酸合成酶的辅助因子，它可催化同型半胱氨酸再甲基化生成蛋氨酸。MTRR变异是造成叶酸/甲基维生素缺乏症E型的主要原因。MTRR 66A→G多态性，导致蛋氨酸被异亮氨酸替代，使该酶活性降低。该基因型对同型半胱氨酸水平有显著影响。有研究指出，MTRR基因A66G多态，血浆同型半胱氨酸增高，基因型为MTRR 66GG，MTRR 66AG的孕妇或胎儿发生神经管畸形的危险性较正常对照组增加。

发明内容

本发明的目的是提供一种采用荧光定量PCR技术检测新生儿神经管畸形致病基因5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶还原酶基因(MTRR)上的相关SNP位点是否发生突变的试剂盒。

本检测试剂盒主要包括以下成分：

(1)检测MTHFR基因上rs1801133号和rs1801131号SNPs多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对：

(2)检测MTRR基因上rs1801394号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对；

(3)常规荧光定量PCR反应试剂，如Taq酶、dNTP混合液、MgCl₂溶液、反应缓冲液、去离子水等。

本检测试剂盒的组分和含量包括：

(1)3μl 10X荧光定量PCR反应缓冲液；