[发明专利]用于检测猪瘟病毒野毒株的引物对、探针、以及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于病毒检测领域，涉及一种用于检测猪瘟病毒野毒株的引物对、探针、以及试剂盒。本发明还涉及一种检测猪瘟病毒野毒株的方法以及所述的引物对、探针、或试剂盒在检测猪瘟病毒野毒株中的用途。

背景技术

猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的猪的高度致死性、接触性传染病，在世界上许多国家和地区均有发生，国际兽疫局将其定为A类传染病，我国《动物防疫法》将其列为一类传染病，给各国养猪业造成巨大的经济损失。我国政府一直都很重视猪瘟的防制工作，并对猪进行猪瘟兔化弱毒疫苗免疫，但随着猪瘟HCLV疫苗的广泛使用，又由于近年来我国猪瘟的流行特点以散发、慢性猪瘟、持续感染和亚临床症状为主，同时存在着与其它病混合感染的状况，因此对其诊断非常困难。目前尚没有简单快速试剂盒能够检测猪瘟病毒野毒株(除猪瘟疫苗株之外的猪瘟病毒株)感染。

实时荧光定量PCR(FQ-PCR，又称为实时荧光RT-PCR)技术包括探针法、染料法和引物法。探针法是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，以Taqman探针为代表，常用的荧光报告基团是FAM、VIC、JOE、HEX等；染料法是采用一种能够与双链DNA小沟结合的荧光染料，荧光信号强弱与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号换算出PCR反应中的双链DNA数量，常用的染料是SYBR green；引物法是利用荧光标记的引物实现定量，目标特异的引物对中的一个引 物3’端用荧光报告基团标记，在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭，在模板存在的情况下，引物与模板配对，发夹结构打开，产生特异的荧光信号。

在荧光定量检测中较常用的是Taqman探针法，根据其3’端标记的荧光淬灭基团的不同又可分为常规Taqman探针和Taqman-MGB探针两种。常规的Taqman探针5’端标以荧光发射基团，3’端标以荧光淬灭基团，该探针在PCR过程中不能被延伸。当探针保持完整时，3’端淬灭基团抑制5’发射基团的荧光发射。在PCR的退火期，探针与引物所含序列内的DNA模板发生特异性杂交。延伸期引物在Taq酶作用下延伸，当到探针处，Taq酶发挥5’-3’外切核酸酶活性，继而发生置换。切断探针后，发光基团远离淬灭基团，荧光信号得到释放。这时荧光探测系统便会检测到光密度有所增加。模板每复制一次，就有一个探针被切断，并伴有一个荧光信号的释放。由于理论上被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系，且光密度同释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系，且光密度同释放的荧光基团的数目也成正比关系，因此该技术可对模板进行准确定量。由于扩增产物较短时效率较高，故扩增长度一般为50-150bp。

Taqman-MGB探针与普通Taqman水解探针不同之处在于Taqman-MGB探针的3’端连接一个不发光的淬灭基团，同时另增加一个小沟结合物(minor groove binder，MGB)分子，比Taqman探针有三大优势：一是显著提高Tm值，可以减少探针设计长度，对AT富含区的探针设计更为有利；二是可以降低背景荧光信号，提高信噪比，使实验结果更精确，分辨率更高；三是提高探针和互补模板的结合特异性，即使一个碱基的不匹配都能精确分辨。

目前检测猪瘟病毒的病原学诊断技术有病毒分离法、免疫荧光技术、兔体交互免疫试验、ELISA抗原捕获、RT-PCR技术和实验动物法等。以上几种方法及其不太成熟的试剂盒通常存在灵敏度低、特异性差、耗时、无法区分免疫群与感染群等诸多问题，不能为我国快速、有效地监控猪瘟疫情提供强有力的技术支持。

公开号为CN101328506A和CN101812539A的专利申请公开了检测猪瘟病毒的试剂盒。但是检测的敏感性有待于进一步提高。此外，CN101328506A中公开的试剂盒生产成本高并且操作繁琐。

因此，亟需一种敏感性高、特异性强、并且快速简便的检测“猪瘟病毒野毒株”的产品和方法。

发明内容

本发明人经过创造性的劳动和大量的试验，得到了能够用于检测猪瘟病毒野毒株的引物对和探针，并且惊奇地发现，所述引物对和探针检测猪瘟病毒野毒株的特异性强、灵敏度高。由此提供了下述发明：