[发明专利]一种检测光滑假丝酵母菌的实时荧光定量PCR试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测光滑假丝酵母菌（光滑念珠菌）的试剂盒，具体地说，涉及一种以实时荧光定量聚合酶链反应技术检测光滑假丝酵母菌的试剂盒。

背景技术

近年来，随着免疫受损人群（包括恶性肿瘤、血液病、艾滋病、SARS、糖尿病、自身免疫病、严重烧伤和创伤、长期吸毒者等）的不断扩大；广谱抗生素、皮质类固醇激素和免疫抑制剂在临床上广泛应用；器官移植、导管插管、介入治疗等新技术的普遍开展，使机会性真菌感染的发病率急剧上升，已经成为院内感染死亡的主要原因之一。

美国国家医院感染监测中心（NNIS）资料显示，20世纪90年代住院患者深部真菌感染率为80年代的1.9倍。1995-2002年美国49所医院连续7年的监测资料表明，念珠菌败血症在医院感染败血症中居第4位，病死率则居首位。

近年非白念珠菌的分离率升高，其中由光滑念珠菌引起的感染明显增加。调查显示1989—1999年，由光滑念珠菌所致的血源性感染上升，是引起念珠菌血症的第2位常见病原菌，从全球范围来看，约占念珠菌血症的15%。

光滑念珠菌也是口腔黏膜的重要病原真菌，由其引起的口腔感染占艾滋病患者口腔念珠菌感染的14%。同样，光滑念珠菌是分离自尿液的第2位常见病原真菌和引起外阴阴道念珠菌病(VVC)最常见的非白念珠菌，从VVC患者病灶部位分离的念珠菌中，光滑念珠菌占34.5%。

与其他非白念珠菌相比，光滑念珠菌引起的感染的病死率最高，为40%~70%，肿瘤患者和骨髓移植患者发生的光滑念珠菌血症的病死率分别高达50%和100%。

由于真菌感染初期症状不明显，临床表现缺乏特征性，早期诊断困难，易导致抗真菌治疗的延迟。而真菌感染尤其是深部真菌感染时病情凶险，常贻误治疗时机。加上光滑假丝酵母菌对常用抗真菌药物包括两性霉素B的敏感性低，且近年来对氟康唑的耐药率呈上升趋势，致使临床使用常见抗真菌药物治疗效果不佳。因此快速准确的诊断和鉴定感染真菌种类对指导治疗用药十分重要，能显著提高机会性真菌感染患者的生存率。

目前真菌感染的临床鉴定主要依赖于显微镜下孢子和菌丝的形态、培养的菌落特征以及生化结果，但这些传统的诊断方法通常周期长、敏感性差、阳性率低，不能满足临床需要。作为金标准的组织病理学和深部组织培养由于其有创性而难于被患者接受。因此，如何提高真菌感染的早期、特异诊断水平是目前临床真菌学领域的研究热点，也是临床检验中要解决的关键问题。

测定循环抗原与抗体的血清学方法，由于发生真菌感染的宿主多免疫受损，缺乏可检测到的抗体，或者抗体产生的变化较大，因此检测抗体对于诊断的意义不大。目前主要检测血液循环中的抗原，如甘露聚糖、(1, 3)-β-葡聚糖及D-/L-阿拉伯糖醇(DA/LA)等，但致病性真菌之间存在交叉抗原，导致血清学检查难以获得满意结果。

分子生物学方法在临床病原性真菌检测中的应用，为提高病原性真菌的检测灵敏度和特异性提供了良好的手段。常用的分子生物学方法有PCR、核酸探针、限制性酶切反应、PCR-RFLP、PCR-SSCP、基因芯片技术等。普通PCR因其易引起实验室污染，很少用于临床检验，通用引物PCR具有快速敏感的优势，但分离的特异性差，尤其不能对光滑念珠菌这种对部分抗真菌药物原发不敏感的菌株进行鉴定；核酸探针为增加特异性需要大量的探针，价格昂贵且耗时，不能用于常规实验室检查；PCR-SSCP、PCR-RFLP、基因芯片技术等敏感性和特异性都较好，但操作比较复杂、仪器设备要求高，多用于科研，目前均不宜用于临床检测。因此，寻找一种能快速、敏感和特异检测病原真菌的方法成为临床的迫切需求。