[发明专利]一种用于快速诊断牛副流感病毒3型的RT-PCR检测方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物医学检测领域，涉及微生物分子生物学检测方法。具体涉及一种用于快速诊断牛副流感病毒3型的RT-PCR检测方法。更涉及快速诊断牛副流感病毒3型的RT-PCR试剂盒的应用。

背景技术

牛副流感由牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus 3，BPIV-3)感染引起，可分为犊牛型和成牛型。犊牛型又称犊牛地方性肺炎，是侵袭2周至数月龄犊牛的一种接触性传染病，以发热、呼吸困难、流浆液、粘液性或脓性鼻漏和咳嗽为特征。因该病多发生于运输后的牛，该病毒又称运输热病毒。牛副流感病毒3型属于副黏病毒科副黏病毒属成员，为单链负股有囊膜的RNA病毒。

自从1959年Reisinger等在美国的牛体中分离到BPIV-3以来，法国、前苏联、日本、丹麦、加拿大、澳大利亚、巴拿马和意大利等国也相继分离出该病毒。由于多种病原导致的呼吸道症状与该病相似，该病的准确诊断方法显得非常重要。国际上有关BPIV-3的诊断研究报道不多，涉及主要方法有：

(一)血清学诊断技术包括补体结合实验、中和实验、凝集实验、免疫扩散、沉淀实验、免疫电泳技术、免疫荧光染色、双抗体夹心ELISA和免疫电镜技术等。在这些方法中得到普遍认同和广泛应用的有：补体结合实验、间接血凝试验。琼脂扩散实验、中和实验。但由于反应时间长，材料多，准备周期长，检测具有明显的滞后性，只能定性不能定量，而且重复性较差。

(二)生物学实验包括动物实验、鸡胚接种和细胞培养。这种检测方法存在敏感不高、耗时较长等问题，而且有些样品中存在抗补体活性，影响检测效果。动物实验成本高，且耗费大量人力物力，经济效益较低。

相比之下，分子生物学方法具有明显优势，如RT-PCR方法特异性好，灵敏度高，不但可以检测活细胞内的病毒核酸，也能直接检测灭活的核酸片段；样品可来源于鼻拭子、喉拭子、呼吸道分泌物等，并可与不同的流感株相区别，这是免疫学方法无法替代的。其他分子生物学方法有荧光定量RT-PCR试剂盒专利号(200910062399.5)，针对的靶基因有HN基因、M基因或F基因等。

发明内容

首先针对目前养牛业健康发展的产业需求，本发明的第一个目的是利用RT-PCR技术建立了一种针对牛副流感病毒3型的快速核酸检测方法，该方法更灵敏，更易于操作。以期为牛副流感的快速诊断和流行病学调查监测和防控提供技术支持；本发明的另一个目的在于通过系统优化反应条件与工艺，制备出相应的诊断试剂盒为临床病原检测和牛副流感防控提供产品。

实现本发明的具体技术方案，在于所述的检测牛副流感病毒3型的RT-PCR方法，步骤包括样品的采集，病毒RNA的提取，特异性引物的设计优化，RT-PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳和结果判定；其特征在于：所述特异性引物是针对牛副流感病毒3型核蛋白基因(NP)的特异性区段设计的，其上下游序列分别为：

P1：5’-GGATGTTTGGGAGTGATCTTGAGTA-3’；

P2：5’-TGTGTTGAAAAATGAAGCAAGACCT-3’；

所述的RT-PCR扩增采用两步法，反转录时加入长度为9bp的随机引物5’-NNNNNNNNN-3’，PCR反应时在反应管内加入上述牛副流感病毒3型的特异性上下游引物P1和P2，RT-PCR反转录反应体系为20μL，包括：8μL RNA，3μL DEPC处理去离子水，1μL随机引物，65℃5min后，迅速放冰上。随后加入5×RT 4μL缓冲液、10μM dNTPs 2μL、0.5μM RNA酶抑制剂1μL、25U/μL M-MLV 1μL，继续反应条件是：30℃30s，99℃5min，42℃20min，4℃5min，获得cDNA；

PCR体系为20μL，包括：灭菌去离子水12.5μL，10×PCR buffer2μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL，dNTPs 1μL，牛副流感病毒3型上下游引物P1，P2各1μL，cDNA样品2μL。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃30s，58℃～62℃30s，72℃1min，循环30次；72℃延伸5min，16℃10min，取PCR产物6μL进行1％琼脂糖电泳，阳性样本和阳性对照品均出现大小为425bp的PCR产物条带，阴性样本和阴性对照品无扩增产物条带。