[发明专利]一种用于快速诊断牛副流感病毒3型的RT-PCR检测方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种检测牛副流感病毒3型的RT-PCR方法，步骤包括样品的采集，病毒RNA的提取，特异性引物的设计，RT-PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳，结果判定，其特征在于：所述牛副流感病毒3型特异性扩增引物，其序列是：

P1：5’-GGATGTTTGGGAGTGATCTTGAGTA-3’；

P2：5’-TGTGTTGAAAAATGAAGCAAGACCT-3’；

所述的RT-PCR扩增采用两步法，反转录时加入长度为9bp的随机引物5’-NNNNNNNNN-3’，PCR反应时在反应管内加入上述牛副流感病毒3型的特异性上下游引物P1和P2，RT-PCR反转录反应体系为20μL，包括：8μL RNA，3μL DEPC处理去离子水，1μL随机引物，65℃5min后，迅速放冰上。随后加入4μL 5×RT缓冲液、10μM dNTPs2μL、0.5μM RNA酶抑制剂1μL、25U/μL M-MLV 1μL，继续反应条件是：30℃30s，99℃5min，42℃20min，4℃5min，获得cDNA；

PCR体系为20μL，其中：灭菌去离子水12.5μL，10×PCRbuffer 2μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL，2.5mmol/L dNTPs 1μL，牛副流感病毒3型上下游引物P1，P2各1μL，cDNA样品2μL；PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃30s，58℃～62℃30s，72℃1min，循环30次；72℃延伸5min，16℃10min。取PCR产物6μL进行1％琼脂糖电泳，阳性样本和阳性对照品均出现大小为425bp的PCR产物条带，阴性样本和阴性对照品无扩增产物条带。

2.一种应用权利要求1的牛副流感病毒3型的RT-PCR快速诊断试剂盒，包括：样品病毒RNA提取试剂，反转录试剂，PCR试剂，阳性对照品和阴性对照品，其特征在于：所述反转录试剂由5倍RT缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂、M-MLV、DEPC处理水、和随机引物组成，保存温度-20℃，反转录反应体系为：8μL RNA，4μL 5×RT缓冲液、3μL DEPC处理去离子水，10μM dNTPs 2μL、1μL RNA酶抑制剂，25U/μL M-MLV 1μL，0.5μM随机引物1μL；所述PCR试剂是由灭菌去离子水、10×PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTPs和cDNA模板，保存温度为-20℃。PCR反应体系包括：灭菌去离子水12.5μl，10×PCR缓冲液2μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μl，2.5mmol/L dNTPs 1μL，牛副流感病毒3型特异性上下游引物P1和P2各1μL。