[发明专利]人脐带间充质干细胞表达人2.5Sβ-神经生长因子及分离纯化的方法

说明书

技术领域

本发明是涉及生物医药技术领域，特别是一种用人脐带间充质干细胞(HUMSC)表达人2.5Sβ-神经生长因子(2.5Sβ-NGF)及分离纯化的方法。

背景技术

神经生长因子(NGF)是神经营养因子中最早被发现，目前研究最为透彻的，具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子，它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。NGF包含α、β、γ三个亚单位，活性区是β亚单位，由两个118个氨基酸组成的单链通过非共价键结合而成的二聚体。NGF在人体内主要分布于脑、神经节、虹膜、心脏、脾、胎盘等组织及成纤维细胞、平滑肌、骨骼肌、胶质细胞、雪旺氏细胞等。NGF与受体结合，通过受体介导的内吞机制产生内在化，形成由轴膜包绕、含有NGF、并保持其生物活性的小泡，经轴突沿微管逆行转运至胞体，经酪氨酸蛋白激酶、脂酰肌醇钙、内源性环腺苷酸等第二信使体系的转导，启动一系列级联反应，对靶细胞的某些结构或功能蛋白基因表达进行调控而发挥其生物效应。

大鼠体内试验结果表明：神经生长因子可改善由己二酮和丙烯酰胺造成的大鼠中毒性周围神经病所致的肢体运动功能障碍，缩短神经-肌肉动作电位潜伏期，并提高神经-肌肉动作电位幅度。组织病理学检查结果表明，神经生长因子有减轻动物胫神经的髓鞘肿胀发生率和降低变性胫神经纤维数量等作用。以上结果提示神经生长因子可能有促进神经损伤修复的作用。目前，生产2.5Sβ-NGF的方法主要从小鼠颌下腺提取，还没见到利用HUMSC表达的报道。

利用HUMSC细胞表达2.5Sβ-NGF是新一代NGF表达系统，它克服了传统大肠杆菌系统不能进行翻译后的修饰活性低等缺点。利用基因重组技术表达人神经生长因子的优点是NGF的结构和功能与人体天然的NGF结构和功能完全一致，没有免疫原性，具有半衰期较长，没有鼠源性病毒交叉感染的安全隐患等优点。在临床上治疗神经损伤，促进损伤神经恢复方面占有重要地位。

发明内容

本发明的目的是提供一种用HUMSC干细胞表达重组人2.5SβNGF，采用等电点沉淀、CM-SepharosFF和SP-SepharoeHP层析三步联用法分离纯化法。

人体脐带间充质干细胞表达人体2.5Sβ-神经生长因子及分离纯化的方法，包括如下步骤：

1、HUMSC原代细胞的分离与培养；

2、传代扩增；

3、冻存：

4、2.5Sβ-NGF克隆、诱导分化与扩增；

5、HUMSC的微载体扩增；

6、2.5Sβ-NGF的分离纯化。

该方法的有益效果是：具有比传统亲和层析、离子交换层析和疏水层析法具有分离规模大、产品纯度高、活性高和收率高等优点。

具体实施方式

实施例1

一、HUMSC原代细胞的分离与培养

1、取破宫产无菌脐带20cm，置无菌生理盐水瓶中，4℃保存。

2、生物安全柜中清洗脐带血渍，将脐带剪成5cm片段，剔除血管，PBS洗涤2次。

3、将8cm长的脐带转移到10cm的培养皿中，加入青霉素和链霉素，浓度分别为100单位/ml和100微克/ml。

4、将脐带剪成10mm³小块，加入10％I型胶原酶和透明质酸酶消化，工作浓度为0.1％(含3mM的CaCl₂，)，混匀，37℃消化4小时。

5、STEMPRO MSC SFM培养：消化液用200目过滤，细胞悬液300G离心5分钟，收集细胞，接种于25T细胞瓶培养，温度37℃，饱和湿度，5％CO₂。

6、3天后换液，除去未贴壁细胞，继续用STEMPRO MSC SFM培养。

二、传代扩增

1、原代细胞培养12天后，培养瓶内细胞达到80％生长面积，集落生长达到95％融合可进行传代，P1代后90％融合后可传代。

2、弃培养基，PBS洗3次，0.5％胰蛋白酶-EDTA消化40秒。

3、STEMPRO MSC SFM中和胰蛋白酶，离心收获细胞，STEMPRO MSCSFM分瓶培养传代。

三、冻存

1、取对数生长期的HUMSC加10％DMSO和FBS于冻存管按冻存曲线在程控降温仪中降温，降温结束后置液氮中保存。

四、2.5Sβ-NGF克隆、诱导分化与扩增