[发明专利]人脐带间充质干细胞表达人2.5Sβ-神经生长因子及分离纯化的方法

权利要求书

1.人脐带间充质干细胞表达人2.5Sβ-神经生长因子及分离纯化的方法，包括如下步骤：

1)、HUMSC原代细胞的分离与培养；

2)、STEMPRO MSC SFM无血清Cytoline 1微载体培养技术传代培养；

3)、细胞冻存；

4)、2.5Sβ-NGF克隆、诱导分化与扩增；

5)、HUMSC的Cytoline 1微载体扩增；

7)、2.5Sβ-NGF的分离纯化。

2.如权利要求1所述的方法，所述步骤一包括以下子步骤：

1)取破宫产无菌脐带20-40cm，置于无菌生理盐水瓶中，4-6℃保存；

2)生物安全柜中清洗脐带血渍，将脐带剪成5-7cm片段，剔除血管，PBS洗涤2-4次；

3)将8-12cm长的脐带转移到10cm的培养皿中，加入青霉素和链霉素，浓度分别为100单位/ml和100微克/ml；

4)将脐带剪成10mm³小块，加入10％I型胶原酶和透明质酸酶消化，工作浓度为0.1％，混匀，37℃消化4-5h；

5)STEMPRO MSC SFM培养：消化液用200目过滤，细胞悬液300G离心5分钟，收集细胞，接种于25T细胞瓶培养，温度37℃，饱和湿度，5％CO₂；

6)3天后换液，除去未贴壁细胞，继续用STEMPRO MSC SFM培养。

3.如权利要求1所述的方法，步骤二包括以下子步骤：

1)、原代细胞培养12-14天后，培养瓶内细胞达到80-90％生长面积，集落生长达到95％融合可进行传代，P1代后90％融合后可传代；

2)、弃培养基，PBS洗3次，0.5％胰蛋白酶-EDTA消化40-70秒；

3)、STEMPRO MSC SFM中和胰蛋白酶，离心收获细胞，STEMPROMSC SFM分瓶培养传代。

4.如权利要求1所述的方法，步骤三包括取对数生长期的HUMSC加10％DMSO和FBS于冻存管按冻存曲线在程控降温仪中降温，降温结束后置液氮中保存的步骤。

5.如权利要求1所述的方法，所述步骤五包括一次性生物反应器小规模STEMPRO MSC SFM培养基，Cytoline 1微载体培养和大规模微载体培养的步骤。

6.如权利要求1所述的方法，所述步骤六包括等电点沉淀以及CM-SepharosFF和SP-SepharoeHP层析分离的步骤。