[发明专利]球虫细胞培养模型及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及细胞培养模型，尤其涉及一种球虫细胞培养模型及其应用。

背景技术

鸡球虫病是由艾美耳球虫寄生于鸡肠道上皮细胞引起的一种原虫病，广泛分布于世界各地，是目前危害养鸡业的重要疾病之一。其生活史较为复杂，需经历孢子生殖、裂殖生殖、配子生殖等发育阶段。细胞培养能为球虫研究提供洁净无污染的环境，同时使人们渴望在“无控”和“透明”环境下研究抗球虫药物的作用机制、活性以及球虫的发育、行为、结构、免疫、遗传、细胞化学和生物化学等的梦想成为现实。球虫的传代细胞培养是球虫在体外合适的传代细胞体系中进行发育的过程，目前多集中于柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)培养方面，子孢子入侵细胞后只能发育为第1代裂殖子或第2代裂殖体阶段，但这并不妨碍传代细胞培养模型在鸡球虫研究领域中的应用。子孢子入侵宿主细胞进行裂殖生殖是球虫感染的关键，是理想的抗球虫药物作用的最佳阶段。此外，球虫的传代细胞培养模型还可以直观呈现虫体(子孢子)入侵宿主细胞后发育的动态变化过程，成为基因或蛋白功能研究有效的展示平台，被广泛用于基因和蛋白功能的研究。但是，目前缺乏高效、应用广泛的球虫细胞培养模型。

鸡胚成纤维细胞系(Chicken Embryo Fibroblast Cell line，DF-1)是一种稳定的传代细胞系，来源于East Lansing Line(ELL-0)鸡胚成纤维细胞，主要用于病毒研究领域，如病毒疫苗生产，重组病毒或蛋白的表达载体。到目前为止，还没有出现将该DF-1细胞培养体系应用于球虫细胞培养并建立球虫细胞培养模型的公开报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种球虫细胞培养模型，该细胞培养模型是首次将DF-1细胞培养体系用于球虫细胞培养而建立的球虫细胞培养模型，其应用广泛、效果好。

此外，还需要提供一种上述球虫细胞培养模型的应用。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

在本发明的一个方面，提供了一种球虫细胞培养模型，所述球虫细胞培养模型是通过将柔嫩艾美耳球虫子孢子接种入鸡胚成纤维细胞系DF-1细胞，并使其在DF-1细胞中发育至第一代裂殖子而建成。

在本发明的另一方面，提供了一种球虫细胞培养方法，包括以下步骤：

将柔嫩艾美耳球虫子孢子接种入DF-1细胞，并使其在DF-1细胞中发育至第一代裂殖子。

优选的，所述DF-1细胞在接入子孢子之前，该DF-1细胞以1～50万个细胞/孔的细胞铺板剂量铺被微孔板。更优选的，所述DF-1细胞在接入子孢子之前，以10万个细胞/孔的细胞铺板剂量铺被微孔板。因为随着DF-1细胞铺板剂量增大，子孢子的入侵率有所降低，结合流式细胞仪检测所需细胞数量考虑，确定最佳铺板剂量为10万个细胞/孔。

优选的，所述柔嫩艾美耳球虫子孢子的接种剂量为1～50万个/孔。更优选的，所述柔嫩艾美耳球虫子孢子的接种剂量为30万个/孔。随着子孢子的接种剂量增大，子孢子的入侵率逐渐增大，但当子孢子接种剂量为30万/孔时，子孢子入侵率的增加趋势平缓，因此确定子孢子的最佳接种剂量为30万个/孔。

优选的，所述DF-1细胞在接入子孢子之后，细胞培养基中添加浓度小于等于5％的血清。当培养基中血清浓度为5％时，子孢子的入侵率最高，但随着血清浓度的增大，子孢子的入侵率逐渐降低，因此确定子孢子接种后培养基中的血清添加浓度不应大于5％。

在本发明的另一方面，还提供了一种球虫子孢子入侵活力的检测方法，包括以下步骤：

用荧光探针标记柔嫩艾美耳球虫子孢子；

将荧光标记的子孢子接种入DF-1细胞培养；

用流式细胞仪检测球虫子孢子的入侵细胞数，并用下述公式计算出子孢子的入侵率，

子孢子的入侵率＝100％×[入侵细胞数/(未入侵细胞数+入侵细胞数)]。

优选的，在荧光标记的子孢子接种入DF-1细胞后8～12小时，用流式细胞仪检测该球虫子孢子的入侵细胞数。子孢子在接种DF-1细胞后8h时入侵率最高，但随着入侵时间的变长，子孢子的入侵率逐渐降低，因此选择在子孢子接种细胞后8-12h检测子孢子的入侵率。

优选的，所述子孢子在荧光标记后的48小时内用于接种DF-1细胞。因为随着标记子孢子保存时间的延长，入侵活力逐渐降低。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述球虫细胞培养模型的应用，用于筛选抗球虫药物。