[发明专利]利用慢病毒载体介导RNAi的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物信息学及分子病毒学技术领域，具体涉及一种基于强力霉素控制的慢病毒载体介导的RNAi研究抗病毒的方法。

背景技术

近年来世界上很多实验室利用siRNA干扰进行抗病毒研究，很多结果要么互相矛盾要么干扰效果不明显。关键的问题是，他们所使用的工作模型大都仅限于使用转染的细胞系。由于转染效率极其有限，难以对进入胞内的siRNA抗病毒效果真正进行评价。后来，RNAi常常利用病毒载体来表达siRNA，其中常见的是逆转录病毒载体和腺病毒载体。但是逆转录病毒只感染分裂期细胞，容纳外源基因的DNA片段不超过8kb；腺病毒载体感染细胞时，病毒DNA游离在细胞核内，并不能整合到宿主染色体中，在体内不能实现稳定的长期表达，而且反复应用容易引起免疫反应，所以来源于人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的慢病毒载体(Lentiviral vector)越来越受到人们的重视。

慢病毒载体既可以感染分裂细胞，也可以感染非分裂细胞如神经细胞、肝细胞、造血干细胞以及肌肉细胞等，转移的外源基因片段大，宿主范围很广，而且降低了重组的机会，最重要的特点是它可以整合到宿主的基因组中，从而可以高效持久的表达外源基因，因而成为广为关注的真核生物基因转移的载体。经修饰过后的慢病毒载体在真核细胞中可以实现诱导调控，比如在慢病毒载体上加入一个多重控制开关，通过四环素或四环素类似物就可以实现对外源基因的可控表达。

慢病毒载体的构建非常简单，原理就是将HIV-1基因组中的顺式作用元件(如包装信号、长末端重复序列)和编码反式作用蛋白的序列进行分离。目前构建慢病毒有二质粒表达系统、三质粒表达系统以及四质粒表达系统。最常用的是三质粒表达系统(包装质粒、包膜蛋白质粒和转移质粒)：包装质粒用来表达HIV-1复制所需的全部反式激活蛋白，但不产生病毒的包膜蛋白及辅助蛋白vpu；包膜蛋白质粒编码水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)；转移质粒中含有H1启动子，能在宿主细胞中持续表达外源基因，同时表达由EF1(Elongation Factor1)启动子驱动的绿色荧光蛋白(GFP)，用于病毒包装时转染效率及感染目的细胞的感染效率的检测。三质粒表达系统的最大优势是使序列重叠的机会大大降低，从而降低了载体重组过程中产生RCV的可能性。

拥有多重控制开关的慢病毒载体系统，能使转染效率大幅度提高到90％以上。为此，我们将利用该系统深入评价siRNA抗病毒的效果。由于极高的转染效率，将会使药物的抗病毒效果得到更真实的评价，将来也更有可能用于体内的特异靶向性药物释放。另外，该体系所拥有的四环素开关，不仅能使研究者详细调查siRNA药物的干扰效果，而且通过开关控制能够追踪药物干预的过程，为探索药物动力学、代谢学和毒理学提供了可能。因此，建立该系统将为抗病毒药物研究提供一个极为实用的工具。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：运用强力霉素控制的慢病毒载体介导的RNAi技术，提供一种利用siRNA研究抗病毒的方法，以便对siRNA药物的干扰作用进行详细评价，而且通过开关控制来追踪药物作用的全过程，为抗病毒药物的研究作出贡献。

本发明解决其技术问题采用以下的技术方案：

本发明提供的是一种基于强力霉素控制的慢病毒载体介导RNAi的方法，具体是：首先，运用相关的生物学软件对相关病毒的核酸序列进行同源性分析，找出保守区域，设计出针对相关病毒保守区域的siRNA；再将合成的siRNA克隆到表达质粒pLVTH中，然后将该表达质粒与pCMV-dR8.91、pMD2.G共同转染293T细胞中，收集转染后细胞上清，经超速离心、纯化、浓缩后形成了表达siRNA的高滴度的慢病毒载体，最后将表达siRNA的慢病毒载体与控制四环素开关的慢病毒载体LV-tTR-KRAB共转导入靶细胞，并且利用四环素类似物DOX来严格控制siRNA药物作用的时间及剂量。

本发明可以采用包括以下步骤的方法：

(1)筛选siRNAs：

先根据GeneBank中HBV的基因序列U95551，参考siRNA设计的原则，在shRNA设计网站http://rnadesigner.classic.invitrogen.com/rnaiexpress/index.jsp选择基因编码区AA开头的长度为21nt、GC％在45％-55％之间的保守核苷酸序列，避开5’和3’端的非编码区，再将选择的序列进行BLAST同源分析，避开与人基因组存在同源的干扰序列。

(2)对筛选出的siRNAs的评价：