[发明专利]利用慢病毒载体介导RNAi的方法

权利要求书

1.一种利用慢病毒载体介导RNAi的方法，其特征是一种基于强力霉素控制的慢病毒载体介导RNAi的方法，具体是：首先，运用相关的生物学软件对相关病毒的核酸序列进行同源性分析，找出保守区域，设计出针对相关病毒保守区域的siRNA；再将合成的siRNA克隆到表达质粒pLVTH中，然后将该表达质粒与pCMV-dR8.91、pMD2.G共同转染293T细胞中，收集转染后细胞上清，经超速离心、纯化、浓缩后形成了表达siRNA的高滴度的慢病毒载体，最后将表达siRNA的慢病毒载体与控制四环素开关的慢病毒载体LV-tTR-KRAB共转导入靶细胞，并且利用四环素类似物DOX来严格控制siRNA药物作用的时间及剂量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于采用包括以下步骤的方法：

（1）筛选siRNAs： 

利用生物信息学筛选出针对相应病毒的几种siRNAs：先根据GeneBank中相关病毒的基因序列，参考siRNA设计的原则，在shRNA设计网站http://rnadesigner.classic.invitrogen.com/rnaiexpress/index.jsp 选择基因编码区AA开头的长度为21nt、GC%在45%-55%之间的保守核苷酸序列，避开5’和3’端的非编码区，再将选择的序列进行BLAST同源分析，避开与人基因组存在同源的干扰序列;

（2）对筛选出的siRNAs的评价：

将不同的siRNAs构建到真核表达载体pSuper中，初步评价这几种siRNAs对病毒是否有影响，其方法是：利用Lipofectamine2000^TM将pSuper-shRNA转染进细胞中，收集转染后细胞上清及细胞，利用分子生物学技术检测相应的病毒指标的变化；

（3）构建表达shRNA的慢病毒载体：

分别将这几种shRNAs克隆到慢病毒转移质粒pLVTH中，然后将构建好的转移质粒pLVTH-HBV-shRNA与包装质粒pCMV-dr8.91、包膜质粒pMD2.G共转导进293T细胞中，收集转导后48h的细胞上清，2500rpm离心5-10min，将上清用0.45μm滤膜过滤，然后24500rpm离心2 hours，弃去上清，最后用Opti-MEM重悬病毒；

（4）测慢病毒载体的滴度：

将重悬病毒按照10倍稀释，然后分别加入各孔中，至培养箱中培养；孵育过夜后，换新鲜的细胞培养液继续培养；48h后观察荧光，数出荧光细胞占9-11%的孔中细胞的数目；再按照以下公式计算出病毒滴度：

Tilter(/ml) = 10% GFP⁺ cells× 总细胞数 × 病毒稀释倍数，

（5）评价构建的慢病毒载体介导的RNAi对病毒的影响：

将构建好的慢病毒载体按照MOI=10的滴度转导进细胞，然后详细评价病毒复制和表达的水平；

（6）构建强力霉素控制的慢病毒载体介导的RNAi系统：

将表达四环素抑制蛋白tTR-KRAB的表达质粒与慢病毒包装质粒pCMV-dr8.91、包膜质粒pMD2.G共转导进293T细胞中，收集48h后的细胞上清，2500rpm离心5-10min，将上清用0.45μm滤膜过滤，然后24500rpm离心2 hours，弃去上清，最后用Opti-MEM重悬病毒，使病毒的滴度与表达shRNA的慢病毒载体的滴度达到一致；

（7）将表达shRNA的慢病毒与表达四环素调控蛋白tTR-KRAB的慢病毒同转导进靶细胞中，然后观察DOX加或者不加的情况下病毒复制和表达水平的变化。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于采用以下方法筛选siRNAs：

先根据GeneBank中HBV的基因序列U95551，参考siRNA设计的原则，在shRNA设计网站http://rnadesigner.classic.invitrogen.com/rnaiexpress/index.jsp 选择基因编码区AA开头的长度为21nt、GC%在45%-55%之间的保守核苷酸序列，避开5’和3’端的非编码区，再将选择的序列进行BLAST同源分析，避开与人基因组存在同源的干扰序列；然后根据pSuper载体的要求，设计60-64nt的两端分别包括Bgl II和Hind III的酶切位点的寡核苷酸链，同时设计一个无关的干扰序列作为阴性对照。