[发明专利]一种分离原代成人肝细胞的方法及其专用无菌器械盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种分离原代细胞的方法，尤其是涉及一种分离原代成人肝细胞的方法，本发明还涉及用于分离原代成人肝细胞的专用无菌器械盒。

背景技术

肝细胞分离方法有多种，如机械分离法、鳌合法和酶消化法等。1956年Sorrentino第一次用机械的方法分离新鲜肝组织，但机械分离法获得的肝细胞，细胞数量少、活性差，逐渐被弃用。1967年Howard创建了胶原酶灌流法(Howard RB，Pesch LA.Preparation and partial characterization of intact isolated parenchymal cells from rat liver.Biol Chem，1968，243：3105-3114)，1972年Seglen进一步将这种方法发展为两步灌流法(Seglen PO.Preparation of isolated rat liver cells.Method Cell Biol，1976，13：29-83)，使获得的肝细胞数量和活性都得到了显著提高，而且减少了肝细胞悬液中的杂质。该方法要求从门静脉置管，经肝脏血管进行灌流，目前已广泛应用于小鼠、大鼠、猪和犬等动物肝细胞的分离培养。对于成人原代肝细胞的分离，利用肝移植手术配型不合而丢弃供肝进行肝细胞分离仍然可以应用该方法，利用手术切除的大块肝脏组织进行细胞分离也可以通过残存的肝脏小血管置管进行肝脏灌流(Lecluyse EL，Alexandre E.Isolation and culture of primary hepatocytes from resected human liver tissue.Methods Mol Biol，2010，640：57-82)。但是，目前肝移植的供肝极为紧张，而因配型不合丢弃的供肝更是稀缺，完全无法满足基础研究中对人肝细胞的巨大需求。随着外科手术技术的发展，伴随病变切除的正常肝组织也逐渐变小，获得的正常肝组织块大多极不规则，很难找到合适的灌流血管，无法实施肝脏灌流，也就无法通过Seglen两步法进行细胞分离。因此，迫切需要一种简便、容易的获取成人肝细胞的方法，从而为应用成人肝细胞进行药物筛选、细胞移植等研究提供技术支持。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种简单、经济的针对小块离体不规则成人肝组织的分离原代成人肝细胞的方法。

本发明的第二个目的是提供一种上述分离原代成人肝细胞的方法专用的一次性无菌器械盒，该器械盒可以即拆即用。

本发明的第一个目的是通过以下技术方案来实现：一种分离原代成人肝细胞的方法，其包括以下步骤：

(1)对已去除结缔组织的离体成人肝组织用针头注射器在组织表面进行多点穿刺，注射前灌流液，直至整块肝组织由暗红色变为灰白色，且流出的前灌流液变清亮；

(2)另取针头注射器在肝组织表面再次进行多点穿刺，注射IV型胶原酶溶液，直至整块肝组织块变疏松、失去弹性，表面呈龟背状裂隙；

(3)分离肝组织，去除残存的包膜和纤维结缔组织，放入无菌瓶中，加入IV型胶原酶溶液在37℃温度下震荡消化得到消化物；

(4)将消化物吹打成为细胞悬液，在冰浴条件下过滤，收集过滤后的肝细胞悬液，移至离心管中，离心处理后去上清液，底层沉淀加入红细胞裂解液，室温静置2～3分钟后，再进行离心，收集底层沉淀，用肝细胞洗涤缓冲液重悬肝细胞，再次过滤、离心处理后弃上清液，收集底层沉淀物；

(5)对步骤(4)中得到的底层沉淀物用无血清DMEM培养基洗涤后得到原代成人肝细胞。

本发明所述步骤(1)中所述的多点穿刺注射为用带针头的注射器在成人肝组织表面选取多个穿刺点，依次穿刺注射前灌注液，穿刺注射总时间控制在10～15分钟的范围内，在实际操作中，注射前灌注液时所选取的穿刺点的个数应根据具体肝组织的大小来决定，并以使整块肝组织全部由暗红色变为灰白色且流出的前灌流液变清亮为判断标准，一般来说，至少需要取20个穿刺点。整个穿刺灌注过程中成人肝组织均在放置于冰袋之上的培养皿中进行。

本发明所述步骤(1)中所述的前灌流液主要成分为NaCl 8g/L、KCl 0.4g/L、Na₂HPO₄·12H₂O 0.12g/L、KH₂PO₄ 0.06g/L、NaHCO₃ 0.35g/L、葡萄糖1.0g/L、HEPES2.38g/L、EDTA 0.74g/L。