[发明专利]一种分离原代成人肝细胞的方法及其专用无菌器械盒

权利要求书

1.一种分离原代成人肝细胞的方法，其特征在于，其包括以下步骤：

(1)对已去除结缔组织的离体成人肝组织用针头注射器在组织表面进行多点穿刺，注射前灌流液，直至整块肝组织由暗红色变为灰白色，且流出的前灌流液变清亮；

(2)另取针头注射器在肝组织表面再次进行多点穿刺注射IV型胶原酶溶液，直至整块肝组织块变疏松、失去弹性，表面呈龟背状裂隙；

(3)分离肝组织，去除残存的包膜和纤维结缔组织，放入无菌瓶中，加入IV型胶原酶溶液在37℃温度下震荡消化得到消化物；

(4)将消化物吹打成为细胞悬液，在冰浴条件下过滤，收集过滤后的肝细胞悬液，移至离心管中，离心处理后去上清液，底层沉淀加入红细胞裂解液，室温静置2～3分钟后，再进行离心，收集底层沉淀，用肝细胞洗涤缓冲液重悬肝细胞，再次过滤、离心处理后弃上清液，收集底层沉淀物；

(5)对步骤(4)中得到的底层沉淀物用无血清DMEM培养基洗涤后得到原代人肝细胞。

2.根据权利要求1所述的分离原代成人肝细胞的方法，其特征在于，所述的步骤(1)所述的离体成人肝组织在体外热缺血时间控制在20分钟以内；而所述的离体人肝组织冷缺血时间控制在30～60分钟内。

3.根据权利要求1所述的分离原代成人肝细胞的方法，其特征在于，所述步骤(1)中多点穿刺注射为用带针头的注射器在肝组织表面选取多个穿刺点，依次穿刺注射前灌注液，穿刺灌注总时间控制在10～15分钟的范围内；所述步骤(2)中的前灌流液成分包含NaCl 8g/L、KCl 0.4g/L、Na₂HPO₄·12H₂O 0.12g/L、KH₂PO₄0.06g/L、NaHCO₃ 0.35g/L、葡萄糖1.0g/L、HEPES 2.38g/L、EDTA 0.74g/L；所述步骤(2)中的前灌注液的温度为4℃，且前灌注液只一次性使用。

4.根据权利要求1所述的分离原代成人肝细胞的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的多点穿刺注射为用带针头的注射器在肝组织表面选取多个穿刺点，依次穿刺注射IV型胶原酶溶液，穿刺注射总时间控制在10～15分钟的范围内；所述的IV型胶原酶溶液的温度为38℃，且IV型胶原酶溶液循环使用；所述步骤(2)的操作全过程在放置于38℃热水袋之上的培养皿中进行。

5.根据权利要求1所述的分离原代成人肝细胞的方法，其特征在于，所述步骤(2)和步骤(3)中所述IV型胶原酶溶液是由IV型胶原酶溶于DMEM培养基配制而成，IV型胶原酶的重量百分比浓度为0.05％-0.1％；所述步骤(3)中所述的震荡消化条件为：在恒温摇床中在37℃下以120～150转/分钟的速度消化15～20分钟；所述步骤(3)中IV型胶原酶溶液的用量根据肝组织大小重量来确定。

6.根据权利要求1所述的分离原代成人肝细胞的方法，其特征在于，；所述步骤(4)中所述的红细胞裂解液的采用浓度为0.15M的氯化铵溶液，所述的红细胞裂解液的用量与肝细胞悬液的体积比为1∶3～1∶4；所述的消化物吹打成为的细胞悬液后采用100目滤网过滤，而肝细胞洗涤缓冲液重悬肝细胞后用200目滤网过滤。

7.根据权利要求1所述的分离原代成人肝细胞的方法，其特征在于，所述步骤(4)中所述的肝细胞洗涤缓冲液采用含DNase I的肝细胞洗涤缓冲液，所述含DNaseI的肝细胞洗涤缓冲液的成分包含DNase I 0.15g/L、CaCl₂ 0.12g/L、MgSO₄·7H₂O0.15g/L；所述的含DNase I的肝细胞洗涤缓冲液的用量是为所述步骤(3)中IV型胶原酶溶液用量的2倍。

8.一种权利要求1～2任一权利要求所述的分离原代成人肝细胞的方法专用的一次性无菌器械盒，其特征在于，其包括盒体和操作器械，所述的操作器械包括培养皿、烧杯、血清瓶、三角烧杯、两个滤网、注射器、15ml离心管、镊子和剪刀；所述盒体内设置多个与所述各个操作器械的形状、体积吻合的凹槽，所述的各个操作器械对应嵌装在相应盒体内的凹槽中。