[发明专利]酵母展示脂肪酶催化合成十二烯基琥珀酸淀粉酯的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种酵母表面脂肪酶催化合成十二烯基琥珀酸淀粉酯的方法。

背景技术

十二烯基琥珀酸淀粉酯(Starch Sodium Alkenylsuccinate，SSAS)是淀粉经十二烯基琥珀酸酐(Dodecenly Succinic Anhydride，DDSA)酯化变性后，在淀粉分子链上引入了亲水亲油两性基团，从而使淀粉分子具有亲水、疏水双重功能，可作为增稠剂、乳化剂、施胶剂和微胶囊壁材而应用于食品、纺织、造纸和制药等工业。目前SSAS大都是由DDSA与淀粉浆在弱碱性条件下经酯化反应生成，在制备方法方面，相较于干法工艺的设备要求高、反应不均一、杂质含量高等缺点，湿法工艺反应均一、稳定性高，但是所得产物取代度不高，且反应效率不高、反应时间过长，导致副反应的发生以及产物水解，从而影响酯化反应效率，并使SSAS成品中掺杂副反应产物。

相较于化学法合成十二烯基琥珀酸淀粉酯，生物酶法可以在较短时间内获得高取代度的反应产物。就相同反应体系而言，生物酶法相比化学法显著提升反应效率和产率，均一度和稳定度也有显著提高。同时，采用生物酶法避免了化学法反应条件苛刻(强酸、碱催化、高温高压)、无特异性、产物复杂、副产物多、分离难、安全性差等弊端。脂肪酶是目前酯化合成中使用最广泛的酶，但是生产成本高、固定化过程繁杂费时大大局限了其商业化应用。

发明内容

本发明提供了一种酵母表面展示脂肪酶催化合成十二烯基琥珀酸淀粉酯的方法，该方法可提高十二烯基琥珀酸淀粉酯合成的酯化反应效率和产率，降低合成成本。

一种酵母表面展示脂肪酶催化合成十二烯基琥珀酸淀粉酯的方法，包括：

将谷物淀粉溶于水，吸涨后加入体积浓度为10～20％的十二烯基琥珀酸酐乙醇溶液和酵母表面展示脂肪酶，在55～65℃下搅拌反应1～1.5小时，分离、纯化制得十二烯基琥珀酸淀粉酯；

以重量份计，反应各原料配比可以如下：水100～120份、谷物淀粉32～35份、十二烯基琥珀酸酐乙醇溶液1～1.2份、酵母表面展示脂肪酶1～2份。

优选的，所述的分离、纯化方法为：将反应液pH值调节至6.5～7.0，经过脱水、醇洗、干燥、粉碎、筛分即得到产品。

优选的，所述的搅拌速率为200～300转/分钟。

所述的酵母表面展示脂肪酶通过如下方法制备：

将线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，将所得转化子接种于BMMY培养基中，诱导培养72～144小时后离心收集菌体，菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母表面展示脂肪酶。

所述的重组质粒由原始载体pPIC9K和依次插入原始载体pPIC9K中MFα1信号肽下游的脂肪酶基因和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因组成。

所述的脂肪酶基因可选用Genbank号为AF229435的序列，毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115为商业化产品，可从Invitrogen公司购得。它的细胞壁α凝集素基因序列的Genbank号为M28164。

载体pPIC9K为商业化产品(如Invitrogen公司)，它存在MFα1信号肽序列(Genbank号：M17301)，同时该载体内信号肽序列上游存在AOX1启动子(Genbank号：Z46233)。重组质粒线性化处理的目的是为了与胞内基因组发生同源重组，提高表达稳定性。

优选的，所述生物印迹所用配体为油酸，它可以诱导酶结构改变，提高转化率。

本发明通过将脂肪酶基因和细胞壁α凝集素基因导入毕赤酵母细胞GS115，毕赤酵母细胞诱导培养后，脂肪酶表达并分泌到胞外，同时利用细胞壁α凝集素将该脂肪酶固定在细胞表面。利用该酵母展现脂肪酶对酯化反应进行催化，不仅提高了操作稳定性、耐热性以及重复性，反应时间也大大缩短，从原来的12小时下降到1～2小时，另外该酵母表面展示脂肪酶生产成本低，催化合成转化效率高。

具体实施方式

实施例1 制备酵母表面展示脂肪酶