[发明专利]酵母展示脂肪酶催化合成果糖棕榈酸酯的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种酵母展示脂肪酶催化合成果糖棕榈酸酯的方法。

背景技术

糖酯是一类应用非常广泛的非离子型表面活性剂，具有无毒、无味、无刺激和可生物降解等突出优点，在食品、化妆品、医药、化工、农业等领域中有着广泛用途和良好发展前景。

糖酯传统的合成工艺是用化学法合成，但糖是多羟基化合物，化学合成的选择性差，酯化特定羟基要有保护和去保护的步骤，故工艺比较复杂；化学合成还有诸如反应条件苛刻、副产物多、易焦化等不足；而脂肪酶的高度选择性可以克服以上缺点，因而有很高的研究价值和很好的应用前景。脂肪酶是目前糖酯合成中使用最广泛的酶，但是生产成本高、固定化过程繁杂费时大大局限了其商业化应用。

发明内容

本发明提供了一种酵母展示脂肪酶催化合成果糖棕榈酸酯的方法，可显著降低果糖棕榈酸酯生产成本，同时达到较高的酯化反应效率和产率。

一种酵母展示脂肪酶催化合成果糖棕榈酸酯的方法，包括：

将果糖和棕榈酸溶于有机溶剂中，加入酵母展示脂肪酶，于50～60℃反应10～14小时，分离、纯化制得果糖棕榈酸酯。

优选的，所述的有机溶剂为丙酮。

优选的，每升有机溶剂中果糖、棕榈酸和酵母展示脂肪酶的加入量分别为20～100g、50～100g、1～2g。

所述反应置于水浴摇床中进行，水浴摇床转速为150～200转/分钟。

优选的，在分离纯化前加入分子筛，继续搅拌反应10～12h，锁住水分，促进酯化反应进一步进行。

所述的分离、纯化为：离心取上清液，旋转蒸发除去有机溶剂，水洗后溶于正己烷，重结晶。

所述的酵母展示脂肪酶通过如下方法制备：

将经线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115，将所得转化子接种于BMMY培养基中，诱导培养72～144小时后离心收集菌体，菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶；

所述的重组质粒由原始载体pPIC9K和依次插入原始载体pPIC9K中MFα1信号肽下游的脂肪酶基因和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因组成。

所述的脂肪酶基因可选用Genbank号为AF229435的序列，毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115为商业化产品，可从Invitrogen公司购得。它的细胞壁α凝集素基因序列的Genbank号为M28164。

载体pPIC9K为商业化产品(如Invitrogen公司)，它存在MFα1信号肽序列(Genbank号：M17301)，同时该载体内信号肽序列上游存在AOX1启动子(Genbank号：Z46233)。重组质粒线性化处理的目的是为了与胞内基因组发生同源重组，提高表达稳定性。

优选的，所述生物印迹所用配体为油酸，它可以诱导酶结构改变，提高转化率。

本发明通过将脂肪酶基因和细胞壁α凝集素基因导入毕赤酵母细胞GS115，毕赤酵母细胞诱导培养后，脂肪酶表达并分泌到胞外，同时利用细胞壁α凝集素将该脂肪酶固定在细胞表面。利用该酵母展示脂肪酶对酯化反应进行催化，可有效提高操作稳定性、耐热性以及重复性，由于酶反应的特异性该酶能大幅度抑制副反应的发生，酯化转化率在85％以上。

具体实施方式

实施例1 制备酵母展示脂肪酶

通过人工合成的方法，合成米根霉(Rhizopus oryzae)的脂肪酶基因(Genbank号：AF229435)和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因(Genbank号为M28164)，同时在脂肪酶基因C端加上连接肽序列GSSGGSGGSGGSGGSGS(linker)，连接后得到核苷酸序列pro-ROL-linker-α-agglutinin，同时在序列两端添加EcoR I和Not I酶切位点，其中pro-ROL为脂肪酶基因，α-agglutinin为细胞壁α凝集素基因。

以上述人工合成序列为模板，利用下述引物对，进行PCR扩增，

上游引物：5’-AAGGAAAAAAGAATTCGTTCCAGTTTCTGG-3’；

下游引物：5’-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTAATGAAACG-3’

PCR反应体系为：模板DNA为1μl，高保真DNA聚合酶0.5μl，dNTP(50mM)0.4μl，上下游引物各0.5μl，10×PCR缓冲液5μl，加水至50μl。