[发明专利]一种景东臭蛙抗菌肽及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明属于生物化学和生物医学领域，涉及一种景东臭蛙抗菌肽及其制备方法和用途。

背景技术

抗生素的发现是20世纪最辉煌的现代医药成果。由于抗生素的临床应用，许多曾被认为是致命的感染性疾病得以治愈，从而显著提高了人类的预期寿命。然而，由于过去30年来滥用和不合理使用抗生素，导致耐药菌株的广泛播散，使抗感染治疗又成了棘手的问题，这必然导致发病率和病死率的上升及医药费用的大幅增加，因此，病原体对抗生素产生耐药性是21世纪全球公共卫生面临的最严重的威胁之一。解决办法一方面是合理使用抗生素，尽量减少耐药菌株的出现，另一方面就是寻找新型的抗菌物质，这已经成为当前的研究热点。抗菌肽具有分子量小、水溶性好、抗原性低、稳定性高等特点，尤其具有不易产生耐药性的特点，尽管抗菌效果略低于传统的抗生素，但在耐药性病原体大量出现的今天，仍被认为是能取代现有抗生素的重要选择。目前，已有多种抗菌肽正在进行临床前的可行性研究。

两栖动物有自己的一套先天免疫系统，其核心就是抗菌肽。两栖动物皮肤已经被公认为是生物活性多肽和生物胺的巨大储存库，其皮肤中含有大量的生物活性分子，是天然的药物资源库。我国现有300多种两栖动物，其中多数为我国特有种，其中有些还是典型的中药或藏药材，显然，它们是一个不可多得的两栖动物活性物质的巨大宝库。景东臭蛙(Odorrana jingdongensis)隶属两栖纲(AMPHIBIAN)无尾目(ANURA)蛙亚科(Raninae)臭蛙属(Odorrana)中的云南臭蛙种组(O.andersonii group)。分布于云南，广西。经我们研究发现，其皮肤具有抗菌活性。通过综合一系列的分离纯化技术，从其皮肤中分离纯化出了一种抗菌肽，取名为景东臭蛙抗菌肽Brevinin-1JDa，它对多种细菌，尤其对几种常见的耐药菌具有抗性，显然具有发展成为抗菌药物的潜力。

发明人将本发明的景东臭蛙抗菌肽Brevinin-1JDa全序列结构经蛋白质数据库进行搜索比对，未发现有任何相同多肽。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的具有抗菌活性的景东臭蛙抗菌肽(发明人命名为Brevinin-1JDa)及其制备方法和用途。

为了实现本发明的目的，本发明提供如下技术方案：

1.景东臭蛙抗菌肽Brevinin-1JDa为我们首次从中国两栖动物景东臭蛙皮肤中分离纯化得到的一种单链多肽，由24个氨基酸组成，理论单一同位素分子量[M+H]⁺(monoisotopic mass)为2600.5183Da，实测单一同位素分子量[M+H]⁺为2600.5214Da，全序列结构为：

NH₂-FLPAVLRVAAKVVPTVFCLISKKC-COOH，或表示为：

Phe-Leu-Pro-Ala-Val-Leu-Arg-Val-Ala-Ala-Lys-Val-Val-Pro-Thr-Val-Phe-Cys-Leu-Ile-Ser-Lys-Lys-Cys，其中第18位和第24位的两个半胱氨酸(即¹⁸Cys和²⁴Cys)为氧化态的二硫键(-S-S-)形式。

2.本发明采用的景东臭蛙抗菌肽Brevinin-1JDa的制备方法：

本方法包括粗提物的获取、凝胶过滤柱层析、阳离子交换柱层析、反相柱层析、反相HPLC柱层析等步骤，具体方法如下：

粗提物的获取：景东臭蛙剥皮晾干，干皮剪碎，浸入乙醇/0.7M盐酸(3∶1v/v)溶液中，反复搅拌浸提，浸提液旋转蒸发去掉盐酸和多数乙醇后，补水并离心，取上清冷冻干燥得到粗提物。

凝胶过滤柱层析：粗提物溶于pH7.0，0.06M的磷酸钠缓冲液，上凝胶过滤柱，柱尺寸1.6cm×60cm，层析介质为Sephacryl S100，洗脱液为pH7.0，0.06M的磷酸钠缓冲液，流速0.5mL/min，上完样后，洗脱405min，280nm下检测紫外吸收值。收集图1中的峰1，得到凝胶过滤样品溶液。

阳离子交换柱层析：凝胶过滤样品用去离子水稀释3.5倍，上阳离子交换柱，柱尺寸1.6cm×20cm，层析介质为CM Sepharose fast flow，上完样后，A液-B液线性梯度洗脱105min，流速5mL/min，215nm下检测紫外吸收值，收集图2中的峰2，得到阳离子交换样品溶液，A液、B液分别为如下液体：

A液：0.02M的磷酸钠缓冲液，pH7.0，

B液：0.02M的磷酸钠缓冲液-0.5M NaCl，pH7.0。