[发明专利]一种景东臭蛙抗菌肽及其制备方法和用途

权利要求书

1.一种景东臭蛙抗菌肽，其特征是：单链多肽，由24个氨基酸组成，理论单一同位素分子量[M+H]⁺(monoisotopic mass)为2600.5183Da，全序列结构为：

NH₂-FLPAVLRVAAKVVPTVFCLISKKC-COOH，或表示为：

Phe-Leu-Pro-Ala-Val-Leu-Arg-Val-Ala-Ala-Lys-Val-Val-Pro-Thr-Val-Phe-Cys-Leu-Ile-Ser-Lys-Lys-Cys，其中第18位和第24位的两个半胱氨酸(即¹⁸Cys和²⁴Cys)为氧化态的二硫键(-S-S-)形式。

2.权利要求1所述的景东臭蛙抗菌肽的制备方法，其特征是：包括以下步骤：

(1)凝胶过滤柱层析：粗提物溶于pH7.0，0.06M的磷酸钠缓冲液，上柱，柱尺寸1.6cm×60cm，层析介质为Sephacryl S100，洗脱液为pH7.0，0.06M的磷酸钠缓冲液，收集图1中的峰1，得到凝胶过滤样品溶液；

(2)阳离子交换柱层析：凝胶过滤样品用去离子水稀释3.5倍，上柱，柱尺寸1.6cm×20cm，层析介质为CM Sepharose fast flow，A液-B液线性梯度洗脱，收集图2中的峰2，得到阳离子交换样品溶液，A液、B液分别为如下液体：

A液：0.02M的磷酸钠缓冲液，pH7.0，

B液：0.02M的磷酸钠缓冲液-0.5M NaCl，pH7.0；

(3)反相柱层析：阳离子交换样品溶液上柱，柱尺寸为1.0cm×30.0cm，层析介质为SOUCE 15 RPC，C液-D液线性梯度洗脱，收集图3中的峰6，得到初步提纯样品溶液，C液、D液分别为如下液体：

C液：0.05％(v/v)三氟醋酸/6.5％(v/v)乙腈/水，

D液：0.05％(v/v)三氟醋酸/51.5％(v/v)乙腈/水；

(4)反相HPLC柱层析：

初步提纯样品溶液上柱，柱尺寸为4.6mm×250mm，层析介质为C-18，E液-F液线性梯度洗脱，收集图4中的主峰，冷冻干燥后得到较纯的景东臭蛙抗菌肽；此较纯的抗菌肽再次上样于同一个反相HPLC层析柱，经0.1％(v/v)三氟醋酸/40％(v/v)乙腈/水等梯度洗脱，收集图5中的主峰的后半峰，冷冻干燥后得到景东臭蛙抗菌肽纯品，E液、F液分别为如下液体：

E液：0.1％(v/v)三氟醋酸/30％(v/v)乙腈/水，

F液：0.1％(v/v)三氟醋酸/60％(v/v)乙腈/水。

3.权利要求1或权利要求2所述的景东臭蛙抗菌肽在制造抗菌药物或抗菌剂中的用途。

4.权利要求3所述的景东臭蛙抗菌肽在制造抗菌药物或抗菌剂中的用途，其特征是：用于制造抗耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、产超广谱β内酰胺酶大肠埃希菌、耐酶抑制剂的β内酰胺酶大肠埃希菌、产I型β内酰胺酶(AmpC酶)阴沟肠杆菌、野生型大肠埃希菌和野生型金黄色葡萄球菌的抗菌药物或抗菌剂。