[发明专利]用骨髓组织块分离及培养禽类骨髓间充质干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞的分离培养技术，具体地说，涉及一种利用骨髓组织块分离及培养禽类骨髓间充质干细胞的方法。

背景技术

骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cell，BMSC)是一群具有多向分化潜能的干细胞，可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成肌细胞、神经细胞和心肌细胞等等。这一特性使得BMSC成为理想的种子细胞应用于组织工程中，在细胞工程、基因治疗及器官移植等领域具有重要意义。BMSC具有单个贴壁生长形成克隆，成为集落形成成纤维样细胞(colony-forming fibroblastic units，CFU-F)。CFU-F成为鉴定骨髓间充质干细胞的手段之一。体外BMSC呈梭形，表达CD44、CD73、CD29、CD106、CD105、CD90等，不表达CD34、CD45和CD14等，由于尚未发现BMSC的特异性标记分子，CD44⁺、CD45^-、CD73⁺、CD29⁺、CD106⁺、CD105⁺、CD90⁺，可用来间接对骨髓间充质干细胞进行表型鉴定。

目前，人和啮齿动物的BMSC的体外分离培养及分化潜能的研究较为广泛，主要方法为密度梯度离心法、贴壁筛选法和免疫分离法。密度梯度离心法根据不同细胞密度不同原理利用Percoll分离液将BMSC分离出来，方法简单，但BMSC获得率较低。贴壁筛选法一般将骨髓吹打为单细胞悬浮液，进行全血细胞贴壁4-12小时，根据不同细胞贴壁特性进行分离得到的BMSC，操作简单，但细胞均一性较差，细胞的实质是多种类型细胞的混合，抗原差异性也较大，细胞克隆化能力、继代培养和扩增能力均较低。免疫分离法可以根据细胞表面标志进行富集或根据表面负表达抗原进行负分选，能更好的分离纯化BMSC，但是对细胞活性影响较大，费用高，所需样本量较大。

目前，针对禽类BMSC的研究相对较少，主要原因在于禽类的BMSC分离困难，基本采用上述已有的方法，费用较高同时存在BMSC获得率和所得细胞分化潜能均较差等缺点。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用骨髓组织块分离及培养禽类骨髓间充质干细胞的新方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种利用骨髓组织块分离及培养禽类骨髓间充质干细胞的方法，其是将禽类骨髓碎块悬浮于胎牛血清中，然后将该血清悬浮液移至培养皿中，倾斜放置一段时间，去除血清后加入完全培养液贴壁培养，获得原代培养细胞；经胰蛋白酶消化后进行传代，然后以完全培养液培养，传代2-4次后获得禽类骨髓间充质干细胞，在体外培养体系中继代扩增培养；其中，所述完全培养液为含有10％胎牛血清的低糖DMEM培养液。

前述的方法，所述倾斜放置是培养皿与水平面呈30-60度角。

前述的方法，倾斜放置放置的时间为40-60分钟。

前述的方法，去除血清后加入完全培养液贴壁培养的时间为3-6天，优选为3天。

前述的方法，原代培养细胞经胰蛋白酶消化后，以1∶2-3的比例传代，优选为1∶3的比例传代。

前述的方法，禽类骨髓来自于禽类的股骨和/或肱骨。

前述的方法，所述禽类骨髓碎块为1～2mm³。

前述的方法，贴壁培养的密度为0.5～1骨髓组织碎块/cm²。

前述的方法，继代扩增培养时细胞接种密度为1×10⁵～1×10⁶个细胞/cm²。

具体地，本发明提供的禽类骨髓间充质干细胞的分离及体外扩增培养方法包括：

1)原代培养：取禽类股骨和肱骨，取出骨髓放入离心管中，用剪刀将骨髓剪碎至1～2mm³，向离心管中加入500～800μl胎牛血清，移液器缓慢吹打至骨髓组织块悬浮，移置到100mm培养皿中，将培养皿放入二氧化碳培养箱中，与水平面呈30～60度角倾斜放置40～60分钟，将血清去除后加入10ml完全培养液培养3天，获得原代细胞。完全培养液成分为低糖DMEM培养液(Dulbecco′s modification ofEagle′s medium Dulbecco，改良Eagle培养基)+10％胎牛血清。