[发明专利]荧光定量RT-PCR检测鸭源性冠状病毒的引物、探针及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及病毒的分子生物学检测领域，具体涉及一种荧光定量RT-PCR检测鸭源性冠状病毒的引物、探针及试剂盒。

背景技术

荧光定量PCR技术最早由美国Applied Biosystems公司于1996年推出，是集PCR扩增技术、探针杂交技术和荧光共振能量转移光谱技术于一体的新兴分子生物学检测方法，其实现了PCR从定性到定量的飞跃。荧光定量PCR技术的原理为：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该方法是目前国际上用在病毒检测上最先进的检测方法之一，与普通的PCR扩增技术相比具有无法比拟的优点：（1）特异性高，因为只有当探针与待测模板匹配时Taq酶才会启动其5’～3’端的外切酶活性，将探针上的荧光基团切割下来而产生荧光强度的增长，因此荧光定量PCR技术克服了普通PCR由于非特异性扩增而导致的假阳性问题；（2）敏感度高，荧光PCR技术可检出极低拷贝数的核酸，使真正意义上的早期诊断成为现实；（3）高通量、高效率，1～2h可全自动同步完成近百个样品的扩增及检测，且结果重现性好；（4）无须凝胶电泳，采用全封闭反应管及光电传导系统，无管道内污染；（5）可对DNA、RNA的PCR产物进行定量分析。

河南省郑州某养殖场2004年5月发生了以腹泻和生长迟缓为主要症状的疑似IB疾病，感染鸡主要表现精神沉郁，下痢，生长缓慢及抵抗力下降，发病率为100%，死亡率达10% 以上，感染鸡群的生产性能显著降低。调查中显示，与鸡舍相距仅150m左右处有一个1700只的肉鸭群，在第一批鸡发病前约10天左右鸭群发生过类似症状的疾病，但没有造成大量死亡。死亡鸡病变主要为小肠出血，肠壁变薄，有的有溃荡，小肠绒毛脱落,腺胃乳头肿大、粘膜脱落，有的肌胃和腺胃交界处有出血，肌胃有出血或溃荡，肾脏肿大，呈“花斑肾”，肺脏无明显变化，法氏囊、胸腺等免疫器官萎缩；病鸭剖检以肾脏肿大，苍白兼有出血、腿肌及肝脏出血为主要特征。在同地区的其他鸡场也发生了同样症状的疾病，虽然经过多种IBV疫苗的免疫但疫情未得到有效控制。河南科技学院动物科学学院开展了对该疫病的研究工作，结果从发病鸭体内分离到一株病毒，鉴定为IBV，命名为鸭源性冠状病毒ZZ2004株（保藏编号为 CGMCC NO.3842），其专利文献公开号为CN 101906404A，此为首次有关家鸭感染IBV的报道。本病毒分离株ZZ2004来自鸡鸭混养的养殖场，其不仅引起鸡的大批发病及死亡，还感染了鸭群，严重影响了家鸭的生长发育并导致鸭的死亡。与其它禽类的冠状病毒相比，鸭源性冠状病毒ZZ2004变异的程度较大，对动物的感染谱更广，其对家禽养殖业的影响更加致命。因此，针对该病毒建立起快速、有效的检测方法就尤为关键。但目前对于该病毒还缺乏有效的新型分子生物学检测方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是一种针对鸭源性冠状病毒ZZ2004毒株的荧光定量RT-PCR检测引物及试剂盒，该试剂盒特异性强，灵敏度高，操作简单，所需时间短，可以对大量的样品进行检测。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种荧光定量RT-PCR检测鸭源性冠状病毒的引物及探针，其核苷酸序列如下：

上游引物：5'-AGGTAGTGGTGTTCCTGATAATGAG-3’（26085-26109），

下游引物：5'-ACGCATCTGGGACTGGTTTTC-3'（26180-26200），

探针引物（P）：5'（FAM）-CCTGGCTTATACCTGGCTTGGCGTCT-（Eclipse）3'（26143-26168）。

与所述上、下游引物相对应的鸭源性冠状病毒ZZ2004的DNA特征片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；与所述探针引物相对应的鸭源性冠状病毒ZZ2004的DNA特征片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

所述上游引物和下游引物对鸭源性冠状病毒ZZ2004株RT-PCR扩增出约117bp的产物。

上述荧光定量RT-PCR检测引物及探针在对鸭源性冠状病毒ZZ2004的鉴别和定量检测中的应用。

一种荧光定量RT-PCR检测鸭源性冠状病毒的试剂盒，含有上述所有引物及探针。

以单样份计量（即检测一个禽只样或待测样的用量），上述荧光定量RT-PCR检测鸭源性冠状病毒的试剂盒的RT-PCR反应体系中含有：