[发明专利]荧光定量RT-PCR检测鸭源性冠状病毒的引物、探针及试剂盒

权利要求书

1.一种荧光定量RT-PCR检测鸭源性冠状病毒的引物及探针，其核苷酸序列如下：

上游引物：5'-AGGTAGTGGTGTTCCTGATAATGAG-3’，

下游引物：5'-ACGCATCTGGGACTGGTTTTC-3'，

探针引物：5'-CCTGGCTTATACCTGGCTTGGCGTCT-3'。

2.根据权利要求1所述的荧光定量RT-PCR检测鸭源性冠状病毒的引物及探针，其特征在于，与所述上、下游引物相对应的鸭源性冠状病毒ZZ2004的DNA特征片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；与所述探针引物相对应的鸭源性冠状病毒ZZ2004的DNA特征片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.根据权利要求1所述的荧光定量RT-PCR检测鸭源性冠状病毒的引物及探针，其特征在于，所述上游引物和下游引物对鸭源性冠状病毒ZZ2004株RT-PCR扩增出约117bp的产物。

4.权利要求1所述的荧光定量RT-PCR检测引物及探针在对鸭源性冠状病毒ZZ2004的鉴别和定量检测中的应用。

5.一种荧光定量RT-PCR检测鸭源性冠状病毒的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的所有引物及探针。

6.根据权利要求5所述的荧光定量RT-PCR检测鸭源性冠状病毒的试剂盒，其特征在于，含有荧光定量RT-PCR反应体系，以单样份计量，该荧光定量RT-PCR反应体系包括：

RNase Free ddH₂O 17.75μL、25μmol/L的dNTP Mixture 1μL、10×PCR Buffer Mg²⁺ 2.5μL、10μmol/L的上游引物F₃ 0.25μL、10μmol/L的下游引物F₄0.25μL、10μmol/L的探针引物0.5μL、5U/μL的 rTaq 0.25μL，且检测时使加入待测样液后的RT-PCR反应体系总体积为25μL。

7.根据权利要求6所述的荧光定量RT-PCR检测鸭源性冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述待测样液的制备方法如下：

（1）取相应的待检组织器官，剪碎放入无菌离心管中，按1g：5mL的比例加入经高压灭菌PBS缓冲液， -20℃下反复冻融2～3次，1000rpm离心5～8min；弃沉淀，取上清于另一无菌离心管中，8000rpm离心8～12min；弃沉淀，取上清于另一无菌离心管中，12000rpm离心8～12min；弃沉淀，取上清于另一无菌离心管中，用0.22μm的滤器过滤，得滤液；

（2）用RNA提取试剂提取RNA，再进行一步法反转录反应，反应体系为：5×Buffer 2μL、 Enzzyme Mix 0.5μL、Random 6 mers  0.5μL、Oligo dT primer 0.5μL、Totall RNA 5μL、RNase Free ddH₂0 1.5μL，总体积为10μL，反应条件为：37℃、15min，85℃、5s。

8.根据权利要求6所述的荧光定量RT-PCR检测鸭源性冠状病毒的试剂盒，其特征在于，以所述试剂盒对待测样液进行TaqMan荧光定量RT-PCR扩增时的反应条件为：

94℃  30s，

94℃  10s                                                    60℃  1min           40 cycle。