[发明专利]咽拭子标本手足口病EV71病毒real-time RT-PCR检测试剂盒及其检测方法

说明书

 

技术领域

本发明涉及一种咽拭子标本手足口病EV71病毒real-time RT-PCR检测试剂盒及其检测方法。

 

背景技术

肠道病毒71型（EV71）是引起手足口病（Hand-foot-mouth disease, HFMD）的主要病原体之一，并可能导致各种神经系统疾病及并发症，以婴幼儿发病为主，个别重症患儿病情进展快，易发生死亡。近年来，国内外报道了多期肠病毒71型感染引起的手足口病群体性暴发的案例，成为威胁人类生命健康公共卫生问题。据卫生部统计数据，仅2010年全国累计报告手足口病例192344例，比2009年同期上升了38.26％，其中重症2119例，死亡94例。人是肠道病毒唯一宿主，患者和隐性感染者均为本病的传染源。肠道病毒主要经粪-口和/或呼吸道飞沫传播，亦可经接触病人皮肤、粘膜泡疹液而感染。传统的肠病毒感染的诊断主要方法是从粪便、咽拭子标本分离病毒，以及病毒的血清型分离鉴定。分子生物学技术为WHO（世界卫生组织）推荐的病原检测手段，其可在短时间内确认病原、大幅节约检测时间和成本，敏感度和特异性也超越现有各类实验室检测技术。

 

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种快速有效、成本、低检测周期短、能够提供有效和临床诊断和流行病监测数据的咽拭子标本手足口病EV71病毒real-time RT-PCR检测试剂盒及其检测方法。

为实现上述目的，本发明咽拭子标本手足口病EV71病毒real-time RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒的引物和探针序列如下:

lsy-VFP2：5’-TGACGAGAGCATGATTGAGACA-3’；

lsy-VRP2：5’- CCGCRCTGCTGAAGAAACTA -3’；

lsy-Probe2：5’- CTTAACTCGCACAGYACAGCTGAGACCAC -3’。

本发明咽拭子标本手足口病EV71病毒real-time RT-PCR检测方法，具体为：

1）根据EV71病毒基因序列，设计引物和探针序列如下:

lsy-VFP2：5’-TGACGAGAGCATGATTGAGACA-3’；

lsy-VRP2：5’- CCGCRCTGCTGAAGAAACTA -3’；

lsy-Probe2：5’- CTTAACTCGCACAGYACAGCTGAGACCAC -3’；

2）提取待测样品RNA;

3）以待测样品RNA为模板，在包括步骤1)所述引物和探针序列的RT PCR反应体系中进行RT PCR反应;

4）采用实时PCR检测仪进行PCR扩增及结果分析，通过荧光定量检测，根据荧光检测的最低Ct值和最高荧光强度判断结果，荧光RT PCR反应呈阳性，则待测样品含有EV71病毒核酸。

进一步，所述待测样品为咽拭子标本，所述待测样品RNA采用QIAGEN病毒RNA提取试剂盒提取。

进一步，所述RT PCR反应体系为：2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 12.5μl ，TaKaRa Ex Taq? HS  5 U/μl  0.5μl，PrimeScript? RT Enzyme Mix Ⅱ0.5 μl ，RNase Free dH2O  4.5 μl，ROX Reference Dye II  50×  0.5μl ，Primer  40μmol/L  各0.5μl，Probe  10μmol/L 0.5 μl。

进一步，所述RT PCR反应的反应条件为：42℃8min；95℃10s；95℃5s；58℃34s，45 Cycles；退火温度按54℃、56℃、58℃、60℃分别试验优化，退火温度为58度时，反应曲线呈典型的S型，荧光信号最强，本方法选择58度作为退火温度进行所述RT PCR反应。

本发明检测方法仅需要咽拭子标本就可能检测，方便了临床医生和口岸检疫工作者采样操作，具有成本低、检测周期短，能够提供有效和临床诊断和流行病监测数据。

 

附图说明

图1为实时PCR最低检测限反应曲线；

图2为实时PCR重复性反应曲线；

图3为CUT OFF值的确定10倍梯度系列稀释反应曲线；

图4为CUT OFF值的确定最低稀释度检测反应曲线；

图5为CUT OFF值的确定阴性样本检测反应曲线。

 

具体实施方式