[发明专利]咽拭子标本手足口病EV71病毒real-time RT-PCR检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.咽拭子标本手足口病EV71病毒real-time RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒的引物和探针序列如下:

lsy-VFP2：5’-TGACGAGAGCATGATTGAGACA-3’；

lsy-VRP2：5’- CCGCRCTGCTGAAGAAACTA -3’；

lsy-Probe2：5’- CTTAACTCGCACAGYACAGCTGAGACCAC -3’。

2.咽拭子标本手足口病EV71病毒real-time RT-PCR检测方法，其特征在于，该检测方法具体为：

1）根据EV71病毒基因序列，设计引物和探针序列如下:

lsy-VFP2：5’-TGACGAGAGCATGATTGAGACA-3’；

lsy-VRP2：5’- CCGCRCTGCTGAAGAAACTA -3’；

lsy-Probe2：5’- CTTAACTCGCACAGYACAGCTGAGACCAC -3’；

2）提取待测样品RNA;

3）以待测样品RNA为模板，在包括步骤1)所述引物和探针序列的RT PCR反应体系中进行RT PCR反应;

4）采用实时PCR检测仪进行PCR扩增及结果分析，通过荧光定量检测，根据荧光检测的最低Ct值和最高荧光强度判断结果，荧光RT PCR反应呈阳性，则待测样品含有EV71病毒核酸。

3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述待测样品为咽拭子标本，所述待测样品RNA采用QIAGEN病毒RNA提取试剂盒提取。

4.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述RT PCR反应体系为：2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 12.5μl ，TaKaRa Ex Taq? HS  5 U/μl  0.5μl，PrimeScript? RT Enzyme Mix Ⅱ0.5 μl ，RNase Free dH2O  4.5 μl，ROX Reference Dye II  50×  0.5μl ，Primer  40μmol/L  各0.5μl，Probe  10μmol/L 0.5 μl。

5.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述RT PCR反应的反应条件为：42℃8min；95℃10s；95℃5s；58℃34s，45 Cycles；退火温度按54℃、56℃、58℃、60℃分别试验优化，退火温度为58度时，反应曲线呈典型的S型，荧光信号最强，本方法选择58度作为退火温度进行所述RT PCR反应。