[发明专利]一种肠衣中多种大环内酯类兽药残留量的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及分析化学、食品安全领域，具体地说，是一种肠衣中多种大环内酯类兽药残留量的检测方法，尤其涉及螺旋霉素、替米考星、竹桃霉素、泰乐菌素、红霉素、罗红霉素、交沙霉素等七种兽药残留量的液相色谱-质谱/质谱检测方法。 

背景技术

大环内酯类抗生素(macrolide antibiotics,MALs)是一类化学结构和抗菌作用相近的碱性抗生素群,属于中谱抗生素，广泛用于畜禽细菌性和支原体感染的化学治疗,同时也是重要的生长促进剂,在动物药品和饲料添加物中占有重要位置。然而当过量或不当使用此类抗生素时,会造成大环内酯类抗生素及其代谢产物的残留,并通过食物链进入人体，在体内器官积累到一定程度，可造成前厅和耳蜗神经损伤，导致眩晕和听力下降，严重者可造成肝肾损伤，高残留对敏感人群会产生致敏性和毒性反应。长期接触会改变人体肠道菌群的微生态环境，造成肠道菌群失调，同时易产生细菌抗药性。 

 MALs在动物性食品中的残留检测和监控与其他兽药一样已受到许多国家的高度重视,目前欧盟、日本、澳大利亚及我国等国家均对MALs提出了限量要求。将对人类健康构成严重危害。

目前，大环内酯类兽药的检测方法主要有：微生物法、免疫分析法（ELISA）、薄层色谱法（TLC）、气质联用法（GC/MS）、高效液相色谱法（HPLC）、液质联用法（LC/MS）、液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS）等。微生物法选择性低，特异性不高，且仅检测单一药物的残留。免疫分析法（ELISA），特别是近来发展的放射受体分析法（CharmⅡ法），涉及的样品前处理简单、快速、特异性好，但难以实现多残留分析。薄层色谱法检测灵敏度较低，不适合食品中MALs残留的微量分析。高效液相谱法测定低限不能满足当前国内外对大环内酯类抗生素残留分析的要求，难以应用。近年来，液质联用法检测大环内酯类抗生素的研究比较活跃。夏曦等采用液相色谱-质谱/质谱法检测猪肉中四种大环内酯类药物残留量；谢丽琪等采用液相色谱-质谱/质谱法测定牛奶中大环内酯类抗生素残留量；谢文等采用液相色谱-质谱/质谱法检测蜂王浆产品中5种大环内酯类抗生素残留量；陈莹等采用液相色谱-质谱/质谱法测定了鳗鱼中大环内酯类、喹诺酮类和磺胺类兽药残留量。但肠衣中多种大环内酯类抗生素残留量检测方法未见报道。本发明旨在利用LC-MS/MS检测技术，建立一种可同时检测肠衣中多种大环内酯类抗生素残留量的检测方法。

发明内容

本发明的目的是克服现有不足问题，提供一种液相色谱-质谱/质谱法检测肠衣中多种大环内酯类抗生素残留量的检测方法。可方便、准确、高效地同时检测肠衣中螺旋霉素、替米考星、竹桃霉素、泰乐菌素、红霉素、罗红霉素、交沙霉素等七种大环内酯类抗生素残留量。 

本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：一种肠衣中多种大环内酯类兽药残留量的检测方法，包括以下步骤：

1、样品提取：

称取5 g均匀肠衣样品置于50 mL具塞离心管中，加25 mL提取溶剂，涡旋，于4000 r/min离心3 min，将提取液收集于50mL容量瓶中，再加20 mL提取溶剂，重复上述操作，合并提取液，加提取溶剂定容至50 mL。精密量取10 mL提取液于20mL离心管中，在45℃以下水浴减压浓缩至近干，用10 mL缓冲溶液分次溶解残渣。

2、固相萃取柱净化

将提取液转移过固相萃取柱，弃去流出液，用5 mL水和5 mL淋洗溶液依次洗涤离心管，洗涤液过C₁₈柱，弃去流出液，负压抽干，用6 mL甲醇洗脱。收集全部洗脱液，在45℃以下水浴减压浓缩至近干，加2 mL样液溶解稀释液溶解，混匀，过0.22 μm 针筒滤膜，进行LC-MS/MS分析。

3、液相色谱-质谱/质谱仪测定

按照色谱条件测定样品和标准溶液，质谱分离采用在正离子模式下进行母离子全扫描，再对其子离子进行全扫描。通过被测样品的质谱和相关信息，得到其定性和定量结果。定性时应当与浓度相当标准工作溶液的相对丰度一致，相对丰度允许偏差不超过规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。定量测定时采用标准曲线法。

作为优选，步骤1中所述提取溶剂为甲醇或乙腈。

作为优选，步骤1中所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，配置方法为溶解13.8 g磷酸二氢钠于950 mL水中，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH值到8.0，最后用水稀释至1。