[发明专利]伊氏锥虫与路氏锥虫二重PCR检测试剂盒及制备方法

说明书

技术领域

本发明公开一种伊氏锥虫与路氏锥虫二重PCR检测试剂盒，用于伊氏锥虫与路氏锥虫快速PCR检测，本发明还提供了该试剂盒的制备方法，属于寄生虫检测技术领域。

背景技术

锥虫（Trypanosoma）是哺乳动物血液中的一种常见鞭毛虫，是一类具有广泛宿主的人畜共患寄生原虫，流行于亚非拉美各大洲。在不同洲流行种类也有所不同，在亚洲及我国主要流行伊氏锥虫(Trypanosoma evansi)和路氏锥虫(Trypanosoma lewisi)。伊氏锥虫传播途径主要经吸血昆虫机械性传播和胎盘感染。在畜牧养殖业中可引起家畜的伊氏锥虫病，造成家畜日渐消瘦，甚至死亡。Joshi等报道印度有感染人的病例。此外，路氏锥虫在世界各地啮齿动物的感染也较为普遍，主要寄生在褐鼠体内，自然条件下通过媒介蚤传播，国外已有人体感染病例报道，2007年有报道泰国确诊病例为路氏锥虫感染；印度也有类似报道。有调查报道我国东北部地区人群中路氏锥虫抗体阳性，人群中可能存在亚临床或误诊病例，目前给我国畜牧业和公共卫生也带来了新的威胁。

发明内容

本发明提供一种伊氏锥虫与路氏锥虫二重PCR检测试剂盒，可用于伊氏锥虫与路氏锥虫的同时快速鉴别和检测。

本发明进一步提供了上述试剂盒的制备方法。

本发明的多种重要水源性人兽共患原虫同时检测试剂盒，包括以下部分：

（1）样本裂解液与DNA提取试剂

样本裂解液：NaCl、Tris-HCl、EDTA、SDS和蛋白酶K的混合溶液；其中，浓度配比为：NaCl 100mM、Tris-HCl(pH 7.5)20Mm、EDTA 25 Mm、SDS 2%（w/v）和蛋白酶K 0.1μg/μl；

DNA提取试剂为酚:氯仿:异戊醇（24:25:1）。

（2）PCR反应液：含反应终浓度各100-300μM的4种dNTPs，反应终浓度各10-100pmol/μl的引物，1.5-4.5mM的Mg2+浓度；DNA聚合酶，灭菌蒸馏水。

（3）二重PCR引物：

伊氏锥虫引物TE-a与TE-s，路氏锥虫引物TL-a与TL-s；

（4）阳性对照：阳性对照为伊氏锥虫DNA和路氏锥虫DNA。

（5）阴性对照：取灭菌蒸馏水为阴性对照样本。

本发明的试剂盒可以含有琼脂糖Agarose（99.0%）、溴酚蓝点样缓冲液（5U/μL）和Taq酶（5U/μL），溴化乙锭（10μg/μL）；还可以含有PCR反应管。

本发明所述试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

（1）样本裂解液与DNA提取试剂

样本裂解液：将NaCl、Tris-HCl、EDTA、SDS和蛋白酶K制成混合溶液；其中，浓度配比为：NaCl 100mM、Tris-HCl(pH 7.5)20Mm、EDTA 25 Mm、SDS 2%（w/v）和蛋白酶K 0.1μg/μl；

DNA提取试剂为酚:氯仿:异戊醇（25:24: 1）。

（2）二重PCR引物：

在GeneBank上比对选取伊氏锥虫和路氏锥虫特异诊断基因，分别RoTat 1.2 VSG基因和18S rRNA基因。

伊氏锥虫（扩增片段大小为482bp）：

TE-a：5'CGGGTCGTCTGCTAAAGT3'

TE-s：5'GCCCGCAGTTGCCTAT3'

路氏锥虫（扩增片段大小为261bp）：

TL-a：5'GAGCTCAAGCGGCAGGTTA3'

TL-s：5' TGCGCGAGAAGAGAGGACT 3'

（3）PCR反应液，含反应终浓度各100-300μM的4种dNTPs，反应终浓度各10-100pmol/μl的引物，1.5-4.5mM的Mg2+浓度；DNA聚合酶，灭菌双蒸水；

（4）阳性对照为伊氏锥虫DNA和路氏锥虫DNA，比较PCR产物以及监测PCR操作过程是否正确；

（5）阴性对照：取灭菌蒸馏水为阴性对照样本，目的在排除反应液中的核酸污染和操作过程中的假阳性问题。

本发明的积极效果在于：利用二重PCR特异性检测方法，根据伊氏锥虫和路氏锥虫种特异基因序列设计引物，通过优化PCR反应体系和条件来提高其敏感性，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后观察结果。本发明可同时对伊氏锥虫和路氏锥虫进行快速准确的检测与鉴别，具有简单方便、灵敏度高、特异性强等特点。

附图说明

图1为本发明二重PCR特异性验证图；