[发明专利]伊氏锥虫与路氏锥虫二重PCR检测试剂盒及制备方法

权利要求书

1. 一种伊氏锥虫与路氏锥虫二重PCR检测试剂盒，包括以下部分：

（1）样本裂解液与DNA提取试剂

样本裂解液：NaCl、Tris-HCl、EDTA、SDS和蛋白酶K的混合溶液；其中，浓度配比为：NaCl 100mM、Tris-HCl(pH 7.5)20Mm、EDTA 25 Mm、SDS 2%（w/v）和蛋白酶K 0.1μg/μl；

DNA提取试剂为酚:氯仿:异戊醇（24:25:1）；

（2）PCR反应液：含反应终浓度各100-300μM的4种dNTPs，反应终浓度各10-100pmol/μl的引物，1.5-4.5mM的Mg2+浓度；DNA聚合酶，灭菌蒸馏水；

（3）二重PCR引物：

伊氏锥虫引物TE-a与TE-s，

路氏锥虫引物TL-a与TL-s；

（4）阳性对照：阳性对照为伊氏锥虫DNA和路氏锥虫DNA；

（5）阴性对照：取灭菌蒸馏水为阴性对照样本。

2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：

还可以含有琼脂糖（99.0%）、溴酚蓝点样缓冲液（5U/μL）和Taq酶（5U/μL），溴化乙锭（10μg/μL）；还可以含有PCR反应管。

3. 权利要求1所述试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

（1）样本裂解液与DNA提取试剂

样本裂解液：将NaCl、Tris-HCl、EDTA、SDS和蛋白酶K制成混合溶液；其中，浓度配比为：NaCl 100mM、Tris-HCl(pH 7.5)20Mm、EDTA 25 Mm、SDS 2%（w/v）和蛋白酶K 0.1μg/μl；

DNA提取试剂为酚:氯仿:异戊醇（25:24: 1）

（2）二重PCR引物：

在GeneBank上比对选取伊氏锥虫和路氏锥虫特异诊断基因，分别RoTat 1.2 VSG基因和18S rRNA基因；

伊氏锥虫（扩增片段大小为482bp）：

TE-a：5'CGGGTCGTCTGCTAAAGT3'

TE-s：5'GCCCGCAGTTGCCTAT3'

路氏锥虫（扩增片段大小为261bp）：

TL-a：5'GAGCTCAAGCGGCAGGTTA3'

TL-s：5' TGCGCGAGAAGAGAGGACT 3'

（3）PCR反应液，含反应终浓度各100-300μM的4种dNTPs，反应终浓度各10-100pmol/μl的引物，1.5-4.5mM的Mg2+浓度；DNA聚合酶，灭菌双蒸水；

（4）阳性对照为伊氏锥虫DNA和路氏锥虫DNA，比较PCR产物以及监测PCR操作过程是否正确；

（5）阴性对照：取灭菌蒸馏水为阴性对照样本；

（6）组装试剂盒。