[发明专利]一种提高动物瘦肉率的新型干扰载体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型载体的构建。具体而言，本发明针对绵羊肌肉生长抑制素基因MSTN的核苷酸序列设计合成miRNA单链寡核苷酸，构建了miRNA慢病毒干扰载体，得到了具有良好应用前景的新型载体。

背景技术

人们对畜禽肉用性状的研究，主要集中在瘦肉率和肉质方面，其中对瘦肉率的追求一直是科学家和生产者努力的重点。肌肉的产量是肉用畜禽的重要经济性状，对畜牧业的经济效益起着决定性作用。近年来，随着分子遗传学的发展及分子生物技术的革新，育种工作者培育出许多生长速度快、瘦肉率高、节省饲料的畜禽品种，并且研究了主宰这些优良经济性状的主效基因。其中，最使人感兴趣的是造成牛肌肉异常发达“双肌”性状的基因。

1997年McPherron等发现了一种分泌型生长、分化因子，将其命名为GDF-8(growth differentiation factor-8)，其特征是在骨骼肌中特异性表达，对肌肉生长有负调控作用，该基因突变可导致骨骼肌肥大，因此也称为肌肉生长抑制素(mystatin，MSTN)。2001年，由Michel Georges领导的研究小组，历经十余年的研究发现比利时蓝牛(Belginm Blue)的双肌性状是由于肌肉生长抑制素基因突变造成的[Hughes SM.Running without regulators.Nature，1992，360：536-537.]。与此同时，由美国农业部的Tim Smith领导的研究小组和由霍普金斯大学的SejinLee领导的研究小组也发现比利时蓝牛及皮尔蒙特牛(Piedmontese)的双肌性状是肌肉生长抑制素基因突变造成的[Jeanplong F，Sharma M，Somers W G，et a.lGenomic organization and neonatal expression of the bovine myostatin gene.Molecular and Cellular Biochemistry，2001，200：31-37.]。通过基因敲除，反义核酸及体内表达肌肉生长抑制素基因拮抗因子的实验，证明肌肉生长抑制素基因是限制肌肉超常发育的负调控基因。MSTN的活性降低或丧失，使得肌肉与其他组织的比例大大提高，因此在畜牧生产上有很好的应用前景。这在脂肪比例较大的家畜中应用潜力很大。

RNAi(RNA interference)是21-23个核苷酸的小分子干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)诱导细胞同源基因mRNA降解、从而特异性抑制基因表达的过程。其作为一项可以高效、特异地降解靶基因mRNA的实验技术已被广泛应用于基因功能的研究[Arziman Z，Horn T，Boutros M.E-RNAi：a web application to design optimized RNAi constructs.Nucleic Acids Res 2005；33：W582-W588]。microRNAs(miRNAs，即微小RNA)是19-23个碱基小分子单链RNA，位于基因组非编码区，进化上高度保守，可在翻译水平对基因表达进行调控。哺乳动物中就可能存在有200-500个miRNA，参与至少10％基因的表达调控[Bartel D (2004).Keystone miRNA and siRNA Symposium.]。人们开始认识到这些普遍存在的小RNA分子在真核基因表达调控中有着广泛的作用。目前已经发现的miRNA中的多数具有和其他参与调控基因表达的分子一样的特征：在不同组织、不同发育阶段中miRNA的水平有显著差异，这种miRNAs表达模式具有分化的位相性和时序性，提示miRNAs有可能作为参与调控基因表达的分子，具有重要意义。