[发明专利]乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒、检测方法、引物及其探针

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，乙型肝炎病毒)属嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae)，基因组长约3.2kb，为部分双链环状DNA。乙型肝炎病毒复制的特点是：肝细胞核内有稳定的共价闭合环状DNA(cccDNA)存在；有一个逆转录步骤。乙型肝炎病毒基因组中已确定的开放读框有4个，分别编码病毒的核壳(C)和包膜(S)蛋白，病毒复制酶(聚合酶)及一种似乎与病毒基因表达有关的蛋白质X。乙型肝炎病毒是目前发现最小的DNA病毒。乙型肝炎病毒是急慢性病毒性肝炎的主要致病因素，感染后可导致不同程度的肝脏损伤。由于乙肝病毒具有传染性强、传播途径复杂、感染过程多样化、流行面广泛、发病率高、治疗困难等特点，多为无黄疸性且许多人为无症状的乙肝病毒携带者，不易被人重视，人体感染后常可导致急、慢性乙型病毒性肝炎，长期的慢性感染可发展成肝硬化、甚至肝细胞癌，是一种潜在的严重威协人类健康的传染病。因此要求对乙型肝炎病毒感染尽快针对不同病情给以恰当的治疗。随着科技的进步，各种各样新的检测方法都应用到致病菌的检测。

现有技术中乙型肝炎病毒的快速检测方法如下：

1、电子显微镜技术

电子显微镜技术有常规电镜法和免疫电镜法。可用电子显微镜直接观察到乙型肝炎病毒颗粒或慢性肝炎患者的肝组织。免疫电镜还可观察到肝细胞胞浆和胞核中的HBcAg和HBeAg，常规电镜法样品用量小、制样速度快、观察比较直观，但观察灵敏度较低，要求样品的病毒量大[10]。而免疫电镜法较常规电镜法的敏感性高，但样品制备过程较复杂，对操作者的技能要求较高。

2、免疫学技术

免疫学检测方法主要是检测乙型肝炎病毒感染过程中产生的抗原抗体免疫标志物。常规的乙型肝炎病毒免疫标志物的血清学检查为五项即：HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb。免疫学检测法主要有酶免疫法(EIA)、固相放射免疫法(SPRIA)及微粒子酶免法(MEIA)。

EIA最常用的方法是酶联免疫吸附试验(ELISA)，是将特异性抗原或抗体吸附于固相载体上，使其与待测样品中的相应抗体或抗原结合，然后加酶标记的抗原或抗体，再加底物显色，最后根据色泽深浅推算待测抗原或抗体的含量。ELISA特异性强。但ELISA检测HBsAg为阴性的样品也可能乙型肝炎病毒DNA为阳性。SPRIA法是利用放射性同位素标记已知的抗原或抗体。该方法灵敏度高，但由于同位素稳定性差、对环境造成污染等原因并不常用。MEIA是近年来发展起来的一种新的抗原抗体检测技术，采用最新的荧光技术，通过测定荧光强度来检测被测物的浓度，但如果被测物抗体呈弱阳性时，则不能轻易诊断出待测物。

3、基因芯片(又称DNA芯片)

基因芯片技术(gene chips)又称DNA芯片(DNA chips)或生物芯片(biological chips)。其原理是将大量特定的寡核苷酸或基因片段作为探针，有规律地和高密度地排列，固定在一块很小的支持物如硅片、玻片等，然后与待检的荧光标记样品核酸按碱基配对原则杂交，经洗涤后通过激光共聚焦荧光系统检测杂交信号强度，再经计算机分析处理数据从而获取样品的生物信息。将特异探针固定在载玻片上，在PCR扩增乙型肝炎病毒分型区域时，应用荧光标记的dNRP使PCR产物带有荧光，通过将PCR产物与乙型肝炎病毒芯片杂交后某型处的杂交点出现荧光而确定。

可用于乙型肝炎病毒的基因变异、基因分型的检测。该技术具有自动化程度高、灵敏度高、检测目的分子量少、效率高等优点，但也存在成本高、假阳性率偏高、重复性差等缺陷。

4、分子生物学方法

错误！未找到引用源。核酸探针法

带有标记物的DNA或RNA片段即核酸探针能与互补的核酸序列特异结合。核酸探针的标记可用核素P32、S35、I131等，以及非放射性物质如生物素、地高辛等。乙型肝炎病毒的核酸探针有DNA探针和RNA探针两种。核酸探针法的主要特点是敏感性、特异性都较强。

错误！未找到引用源。普通PCR法

PCR法通过两段特异性寡核甘酸引物，在体外经DNA聚合酶催化，扩增与两引物互补的DNA序列之间的区段，检测样品中是否有该序列。PCR较血清学方法更敏感，但特异性和重复性较低，若结合斑点杂交、微孔板杂交、滤膜核酸探针杂交等核酸杂交方法和酶联免疫等方法对PCR产物进行分析，灵敏度和特异性均可大大提高。