[发明专利]乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒、检测方法、引物及其探针

权利要求书

1.一种乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有：

(1)PCR反应液，其中包括DEPC处理水、具有5’→3’外切活性的DNA聚合酶、dNTPs、10×PCRBuffer、含有Mg²⁺离子的溶液、乙型肝炎病毒正向引物、乙型肝炎病毒反向引物、乙型肝炎病毒探针；

乙型肝炎病毒正向引物如序列表中SEQ  ID  NO.1所示：5′-TTGTCCTGGYTATCGYTGGAT-3′，

乙型肝炎病毒反向引物如序列表中SEQ  ID  NO.2所示：5′-TGAGGCATAGCAGCAGGATGA-3′，

乙型肝炎病毒探针如序列表中SEQ ID NO.3所示：5′-CTGCGGCGTTTTAT-3′；

其中，所述荧光探针的5’端和3’端分别用荧光基团修饰；所述引物序列中，Y＝(C/T)；

(2)DNA提取液；

(3)阴性质控品，为不含乙型肝炎病毒Pre-S基因的pUCm-T载体质粒DNA片段；

(4)阳性质控品，为1.0×10⁶copy/mL含乙型肝炎病毒基因组DNA片段；

(5)临界阳性质控品，为1.0×10⁴copy/mL含乙型肝炎病毒基因组DNA片段；

(6)工作标准品，为含有乙型肝炎病毒的高度保守基因-Pre-S基因的71个碱基对的核苷酸片段的pUCm-T重组质粒，该质粒在大肠杆菌DH5α中增殖。

2.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，其中荧光探针的5’端修饰的荧光染料选自：FAM，HEX，TET，JOE，VIC，ROX，Cy3或Cy5；3’端修饰的荧光染料选自：TAMRA、Eclipse，BHQ1，BHQ2，BHQ3或DABCYL。

3.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，所述DNA提取液由溶液A和溶液B组成；

所述溶液A，为聚乙二醇6000；

所述溶液B，其中包括乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸钠、Tris-HCl、乙基苯基聚乙二醇。

4.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，所述工作标准品包括：

a、工作标准品1，含有1.0×10⁷copy/mL的乙型肝炎病毒Pre-S基因的非传染性DNA片段；

b、工作标准品2，含有1.0×10⁶copy/mL的乙型肝炎病毒Pre-S基因的非传染性DNA片段；

c、工作标准品3，含有1.0×10⁵copy/mL的乙型肝炎病毒Pre-S基因的非传染性DNA片段；

d、工作标准品4，含有1.0×10⁴copy/mL的乙型肝炎病毒Pre-S基因的非传染性DNA片段。

5.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，所述具有5’→3’外切活性的DNA聚合酶为Taq酶。

6.根据权利要求5所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，

所述PCR反应液各组分含量的配比为：DEPC处理水用量27.5μL；浓度为5U/μL的热启动Taq酶用量0.3μL；浓度为10mmol/L的dNTPs用量1μL；10×PCR Buffer用量5μL；浓度为25mmol/L的MgCl₂溶液用量7μL、浓度为10μmol/L的乙型肝炎病毒正向引物用量1.6μL、浓度为10μmol/L的乙型肝炎病毒反向引物用量1.6μL、浓度为10μmol/L的乙型肝炎病毒探针用量1μL。

7.根据权利要求3所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，

所述聚乙二醇6000的浓度为15％；所述SDS浓度为0.5％；所述Tris-HCl的pH值为8.0；所述乙基苯基聚乙二醇的浓度为0.1％。