[发明专利]一种高效液相色谱-荧光法同时测定血清中酪氨酸、色氨酸和5-羟色胺含量的方法

说明书

技术领域：

本发明属于分析化学领域，涉及一种定量测定血清中酪氨酸、色氨酸和5-羟色胺含量的研究方法，特别涉及一种运用高效液相色谱-荧光法同时测定血清中酪氨酸、色氨酸和5-羟色胺含量的相关技术。

背景技术：

酪氨酸(tyrosine，Tyr)属于人体的非必需氨基酸，由苯丙氨酸(phenylalanine，Phe)经苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase，PAH)脱去羟基转化而来，是合成儿茶酚胺类神经递质-多巴胺、肾上腺素和去甲肾上腺素的前体物质，与神经元的传递有重要关系。L-色氨酸(L-tryptophan，L-Trp)是人体内必需氨基酸之一，参与人体蛋白质合成和代谢调节，是5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)的前体物质，而5-HT是人体内重要的神经递质，可能是中枢神经系统病变的神经生物学基础。研究表明，Tyr、Trp和5-HT三种氨基酸在人体神经精神系统中均发挥着重要的作用。

目前，国内外报道测定Tyr、Trp和5-HT的方法有很多，其中，报道最多的为运用HPLC法测定其中的一种或者两种进行测定，但未见采用HPLC-FLD同时测定血清中Tyr、Trp和5-HT含量的报道，本发明利用Tyr、Trp和5-HT具有自然荧光的特性，在国内外首次公开一种同时测定血清Tyr、Trp和5-HT含量的HPLC-FLD，血清标本去蛋白后取上清直接进样，Tyr、Trp和5-HT通过色谱柱分离后，通过波长转换，在特定的时间段，以各自的最适荧光激发和发射波长进行检测。

发明内容：

本发明的目的是公开一种能够同时测定血清中Tyr、Trp和5-HT含量的HPLC-FLD法，可满足医疗临床工作和科研对于Tyr、Trp和5-HT的快速、准确测定。

一种高效液相色谱-荧光法同时测定血清中酪氨酸、色氨酸和5-羟色胺含量的方法：以Atlantis C18色谱柱为固定相，所述色谱柱规格为4.6mm×150mm i.d.，5μm；以0.1mol/LKH₂PO₄：甲醇混合溶液为流动相，所述0.1mol/L KH₂PO₄与甲醇的体积比为85∶15；流动相pH值为4.3；流速为1.0ml/min；将待测样品经色谱柱洗脱、分离后，用荧光检测器进行分析、测定；荧光检测器激发波长和发射波长0～4min分别为228nm和306nm，4～7.5min为278nm和338nm，7.5min后为285nm和353nm。

所述的荧光检测器为多波长荧光检测器，具有多通道，可调波长的特点。

所述的流动相使用前，用0.22μM的微孔滤膜过滤，超声脱气20min。

酪氨酸、色氨酸和5-羟色胺的标准工作液配制方法如下：准确称取酪氨酸、色氨酸和5-羟色胺，用2.5％v/v的高氯酸溶液溶解、混匀；分别配制成55μmol/L、49μmol/L、1.176μmol/L的标准工作液。

待测血清样品的处理：将空腹静脉血2ml于促凝管内，常温常速离心分离血清，取血清于eppendorf管内，加入等量5％高氯酸溶液，充分混匀后室温放置10min，10000r/min离心10min，取上清液20μL进样分析。

本发明利用Tyr、Trp和5-HT三种氨氨基酸均具有自然荧光的特性，并经过大量实验条件的摸索，建立了一种能同时测定血清Tyr、Trp和5-HT含量的HPLC-FLD法，本方法简单、快速，血清标本去蛋白后，取上清液直接进样，Tyr、Trp和5-HT通过色谱柱分离后，采用波长转换，在特定的时间段，以各自的最适激发和发射波长进行检测，10min即可完成检测，本发明明显优于已公开的技术，简便、快速、灵敏度高，无需柱前、柱后衍生；因此是一项非常值得广泛应用、推广的技术。

附图说明：

图1为混合标准品Tyr、Trp和5-HT的色谱图；

图2为正常成人血清样品Tyr、Trp和5-HT的色谱图。

具体实施方式

下面结合实施方式和实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

本发明方法的建立过程：

1仪器和试剂：