[发明专利]一种林木外生菌根真菌彩色豆马勃的分子检测方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物的分子检测技术领域，具体涉及一种林木外生菌根真菌（Ectomycorrhizal fungi, EMF）彩色豆马勃（Pisolithus tinctorius）的分子检测方法。

背景技术

外生菌根是真菌与植物根系相互作用形成的互惠共生体，是森林植物正常生长必不可少的部分，具有重要的生态环境效益和经济价值。准确描述和鉴定外生菌根真菌（Ectomycorrhizal fungi, EMF）是研究外生菌根在自然森林生态系统中功能的最基本要求之一，特别是在进行外生菌根种类和分布状况的野外调查时，对菌根真菌的监测也需要鉴别EMF。同时，对EMF鉴定也可应用于检测接种了外生菌根食用真菌的植物质量，以确保被接种的植物在生产过程中没有被其它真菌污染。彩色豆马勃（Pisolithus tinctorius ）是一种地理分布广泛、寄主范围广、对林木有益的EMF，分布于世界三十多个国家，能够与松树（Pinus）、桉树（Eucalyptus）、栎树（Quercus）、桦木（Betula）等多种林木形成菌根，在苗圃育苗、树木移栽和人工造林时具有提高幼苗成活率、促进树木营养吸收、提高树木抗病和抗逆境胁迫的能力。传统的EMF鉴定是通过真菌子实体颜色、形状和其它的宏观特征进行鉴定，后来辅以菌索和真菌细胞的显微结构等进行鉴定。但是，由于大多数EMF种类在野外或离体培养时不易形成子实体，因此对EMF进行形态学描述及鉴定存在一定困难。另外，相近种的EMF所形成的菌根往往具有相似的形态学结构，容易混淆，所以探寻合适的检测EMF的方法是目前亟待解决的一个重要问题。

真菌核糖体rDNA的ITS区是一段中度或高度保守序列，其保守性表现为种内相对一致，种间差异比较明显，因此为真菌的分子检测提供了理想的靶序列，再加上分子生物学和生物信息学的发展，许多真菌的rDNA ITS区序列被测定并且向GeneBank等三大数据库提交，为通过ITS区序列来研究EMF的分子检测提供了方便。一系列基于rDNA ITS区的分子生物学检测外生菌根的方法应运而生，主要的分子生物学方法如限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP）、简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)、序列扩增特征区（Sequence Characterized Amplified Region，SCAR），还有设计特异性引物扩增ITS区和设计专一性探针进行分子杂交检测和鉴定EMF，这使得对EMF的检测脱离了对形态学的依赖。但是这些方法也存在一些不足，如费用比较昂贵、检测对象DNA质量不高或DNA浓度太小时难于分析等。而且，土壤中存在多种PCR扩增抑制剂，如腐殖酸等，会对PCR扩增产生严重影响，另外，从植物菌根中只能获得少量的真菌DNA，这些因素给EMF的分子检测带来了不便。同时，对EMF分子检测时，设计出特异性引物也是技术的关键。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种林木外生菌根真菌彩色豆马勃的分子检测方法，以期为林木EMF彩色豆马勃的检测和评估提供一种准确、快速的途径。

发明内容：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：一种林木外生菌根真菌彩色豆马勃的分子检测方法，以待测样品DNA为模板，以通用引物ITS1-F/ITS4-B、引物PtF和引物PtR为特异性引物，分别进行巢式PCR的第一、二轮反应，产物进行电泳检测，即可快速检测松树外生菌根中的彩色豆马勃；所述的引物PtF序列为：5'-GGGACCTGTGCGTTTCGT-3'；引物PtR序列为：5'-CATGCCCACCCGCTAATG-3'。

一种林木外生菌根真菌彩色豆马勃的分子检测方法，具体步骤如下：

（1）采用CTAB法提取待测样品的DNA，在进行组培苗和实生苗菌根DNA提取时，当DNA溶于100ul TE溶液后，再次加入200ul CTAB重复提取一次；